著絲粒\\(centromere\\)是真核生物染色體的重要組成元件, 在細胞分裂過程中, 它作為染色體著絲點復合體形成和微管附著的位點, 與細胞有絲分裂和減數分裂染色體行為密切相關.雖然著絲粒在不同真核生物細胞分裂過程中的功能極為保守, 但是, 令人吃驚的是著絲粒在蛋白結構、DNA序列和裝配方式等在不同的真核生物之間卻表現出極大的差異. 早在19世紀80年代, Flemming就對著絲粒進行了描述, 但在關于著絲粒中包含的蛋白類型、DNA構成方式等結構和功能的研究上, 因涉及到復雜的基因組遺傳學與表觀遺傳學的機制, 還遠遠沒有揭開.真核生物著絲粒的基本單位是著絲粒核小體在著絲粒核小體中含有組蛋白H3的一種變種蛋白即著絲粒特異性組蛋白H3, 它是微管與染色質連接體的重要組成部分.著絲粒組蛋白在人和其他哺乳類中被稱為CENP-A, 在果蠅中被稱為CID, 在酵母中被稱為CSE4, 在線蟲中被稱為HCP3等.生命體內常規核小體結構早在上個世紀70年就已經被確定, 常規核小體由組蛋白H2A、H2B、H3和H4,每一組蛋白各兩個拷貝形成八聚體, 由直接纏繞在組蛋白八聚體上所形成.然而, 在真核生物的著絲粒區域, 著絲粒核小體是如何構成的一直沒有統一的答案.近幾年, 人們利用體外vitro\\)和體內\\(in vivo\\)實驗, 提出了著絲粒核小體結構的八聚體、六聚體、同型四聚體以及半八聚體模型\\(圖1\\), 對不同生物的著絲粒核小體結構進行了深入的探討.
1 著絲粒核小體模型
1.1 八聚體著絲粒核小體模型
目前, 著絲粒核小體八聚體模型的主要實驗證據多為體外組裝實驗所獲得.根據含有CENP-A組蛋白的數量, 分為同型八聚體和異型八聚體兩種.
其中, 同型模型中含有CENP-A、H4、H2A和各兩個蛋白; 而異型模型中除H4、H2A與H2B的數量與同型模型中相等外, H3和CENH3均為一個拷貝.體外組裝實驗研究發現, 由于CENP-A比CENP-A-H3的親和力更強, 因而更容易形成同型的八聚體.如圖2虛線部分所示, 根據體外重組著絲粒核小體X射線衍射結果, Tachiwana等發現人類著絲粒核小體上所纏繞的DNA為121 bp, 比常規核小體的147 bp更短.其中著絲粒核小體中每個\\(CENP-A -H4-H2A-H2B\\)四聚體上纏繞的DNA均比傳統核小體\\(H3-H4-H2A-H2B\\)四聚體少.
Hasson等也通過染色質免疫共沉淀測序seq\\)技術證實, 人類著絲粒核小體上纏繞的DNA的長度短于傳統核小體上纏繞的DNA.
1.2 半八聚體著絲粒核小體模型
半八聚體模型是在一個核小體中只含有一份拷 貝 的CENP-A、H4、H2A和H2B.Dalal等和Dimitriadis等通過體內實驗\\(in vivo\\)利用原子力顯微鏡發現, 在果蠅和人類細胞中含有的核小體的高度只有常規核小體的一半, 而且在果蠅中著絲粒核小體無法通過交聯的方式形成八聚體.Krassovsky等利用高通量測序及技術發現酵母著絲粒核小體所結合的DNA在左右, 這也遠遠小于八聚體模型中的147 bp或者121 bp.Densmore等的研究發現, 酵母著絲粒核小體的結合區域為序列, 而CDE序列中又可以分為CDE I、CDE II和CDE III三個元件, 其中CDE I為Cbf1蛋白的結合位點, CDE III為CEBF3著絲粒復合體的結合位點\\(圖3B\\).如圖3A所示, 圖中橫坐標為CSE4染色體免疫共沉淀\\(anti-CSE4 ChIPed\\)讀段\\(Reads\\)中點到CDE序列中點的距離, 縱坐標為讀段的長度.我們可以發現, 圖3A中存在12 bp、125 bp和25 bp的保護區域, 這表明存在這三種不同長度的DNA片段被蛋白保護, 由于12 bp和25 bp為CBF1和CBF3所保護的區域, 從而計算出酵母著絲粒核小體所結合的序列是大約在80 bp左右.
與此同時, 在Cbf1蛋白突變株cbf1?中, 小于的片段要遠遠多于野生型酵母.另外, 在CDE I區域也不存在被蛋白所保護的DNA, 這說明了酵母著絲粒核小體的核心區域所保護的DNA在80 bp左右\\(圖3C\\).Furuyama等發現, 通過調整鹽濃度, 在體外組裝得到了含有CSE4的半八聚體著絲粒核小體, 解釋了為什么不同的實驗室的體外實驗可以獲得不同的著絲粒核小體結構.根據上述實驗, 我們可以清楚地得出, 如果酵母著絲粒核小體為八聚體, 是可以保護全部CDE, 而這與cbf1?突變實驗相互矛盾, 這也證實酵母著絲粒核小體為半八聚體結構, 并被大約80 bp的DNA所纏擾\\(圖3D\\).
1.3 三聚體/六聚體模型和HJURP/Scm3
蛋白伴侶在芽殖酵母中, 研究表明存在一種僅含有CSE4、H4和SCM3的蛋白復合體, 而該復合體可能有助于著絲粒核小體的形成.而在人類中, 也發現了類似的蛋白復合體, 與酵母不同的是與Scm3起相同功能的蛋白是HJURP, 該三聚體的結構已經通過X射線衍射獲得\\(圖1\\).而六聚體模型, 則是含有兩份拷貝的CSE4、H4和\\(圖1\\).通過體外組裝實驗發現, 三聚體模型中的HJURP蛋白伴侶能與DNA結合.
1.4 四聚體模型
Williams等和Aravamudhan等分別在芽殖酵母的著絲粒核小體中, 發現存在一種只有兩份拷貝的CSE4和H4蛋白復合體\\(圖1\\), 而該復合體中并不含有H2A和H2B.
2 、著絲粒核小體DNA的纏繞方式
傳統的八聚體核小體的DNA纏繞方式為負超螺旋結構.而在著絲粒核小體中, Furuyama等構建了含有酵母著絲粒的微小染色體, 通過對該微小染色體中著絲粒核小體的分析發現, DNA在著絲粒核小體上的纏繞方式為正超螺旋, 這與傳統核小體的負超螺旋結構明顯不同.
3 、細胞周期與著絲粒核小體的關系
常規核小體的模型早在幾十年前就已經被確定, 而為何一個功能極其保守的著絲粒核小體結構會有這么多的模型而且各種模型之間互不相容, 這是一個值得深入探究的問題.首先, 體外重組裝實驗通常都采用在某種鹽濃度條件下進行, 多數情況都沒有蛋白伴侶的參與, 這導致了在同一條DNA上不能通過體外組裝產生超過3個八聚體著絲粒核小體的串聯結構.其次, 由于交聯劑\\(如甲醛的使用通常會破壞蛋白的結構, 也影響了核小體的結構.再次, 由于細胞環境是動態的, 不同細胞周期著絲粒核小體的結構可能會存在一定的差異.
使用原子力顯微鏡進行著絲粒結構的觀察, 不需要進行交聯處理和超低溫冷凍等可能使核小體結構發生改變的預處理, 這為觀察天然狀態下的著絲粒核小體提供了有利條件.
在2011年, Black等提出了半八聚體/三聚體四聚體和八聚體之間的細胞周期轉換模型, 他們認為在細胞內存在多種狀態的著絲粒核小體, 首先在期細胞中存在八聚體、四聚體、半八聚體、六聚體以及三聚體, 然后經過DNA復制, 在S期細胞中著絲粒核小體為八聚體并含有半八聚體, 而進入M期后均為八聚體.隨著研究的深入, 這種模型得到了修訂.Bui等利用原子能顯微鏡觀察發現, 著絲粒核小體的大小隨著細胞周期的變化而變化.其中/S期和/M期的著絲粒核小體明顯小于S期著絲粒核小體\\(表1\\).而S期的著絲粒核小體的大小與體外組裝的常規核小體及著絲粒核小體大小相當.這就說明著絲粒核小體在S期可能是八聚體, 而在其他時期為半八聚體\\(圖4\\).根據進一步的實驗, 發現在期HJURP蛋白不與著絲粒核小體結合, 在S期與期著絲粒染色質的核小體排布比較規則, 核小體與核小體之間存在開鏈染色質結構.
Shivaraju等通過熒光能量共振轉移resonance energy transfer, FRET\\)實驗發現, 在酵母細胞中, 隨著細胞周期的改變, 著絲粒核小體也存在八聚體和半八聚體之間的轉換.
4 、著絲粒核小體結構
動態變化的生物學解釋首先, 著絲粒組蛋白伴侶只在、/S和S期定位于著絲粒, 而這些時期著絲粒核小體均呈現半八聚體結構.這是因為蛋白伴侶HJURP/Scm3會和CENP-A組蛋白進行競爭性結合, 如果一個組蛋白結合了HJURP/Scm3后就無法結合另外一個CENP-A而形成八聚體, 而HJURP/Scm3可以介導半八聚體轉化為八聚體.然后, 在著絲粒核小體為八聚體結構時, CENP-A第124位的賴氨酸\\(CENP-A K124\\)和H4的97位賴氨酸均被乙?；?
其中, 八聚體著絲粒核小體的CENP-A K124與傳統核小體的H3K122均位于纏繞核小體的中心位置, 且H3K122在通常情況下是被乙?；? 傳統核小體H3K122去乙?；瘯绊懞诵◇w的穩定性.而在半八聚體的著絲粒核小體中發現CENP-A K124處于未被乙?；臓顟B.據此我們可以推斷, 著絲粒核小體八聚體結構的形成與CENP-A K124的乙?；幸欢ǖ年P系.與此同時, 在人類著絲粒間期細胞復合體\\(interphase centromere complex\\)中發現了去乙?；鞍酌? 這也從另外的層面表明著絲粒核小體在細胞分裂間期需要去乙?；鞍酌傅膮⑴c而形成半八聚體.
DNA的半保留復制模型許多年前就已經確定而生命體的表觀遺傳信息如組蛋白修飾是否在細胞復制過程中進行傳遞, 目前還存在爭論.例如, 含有H3.3的核小體遵從半保留復制的基本理念, 核小體八聚體的中的兩份H3.3組蛋白被均勻地分配到子代細胞中.而含有H3.1的核小體則不遵循半保留復制的原則, 含有H3.1組蛋白的核小體在子代細胞中一個核小體上的兩份H3.1要么全部由父代細胞獲得, 要么全新合成, 不存在半保留的機制.而著絲粒核小體組蛋白是怎樣遺傳到子代細胞中, 目前尚不清楚.目前, 我們只知道在S期細胞中, 含有的核小體會臨時占據以前含有CENP-A的著絲粒核小體的位置, 而蛋白伴侶HJURP如何識別H3.3與CENP-A的著絲粒組蛋白、如何遺傳給子代細胞, 仍然有待研究.5 展望不同物種中著絲粒特異組蛋白異構體同源物的存在, 使真核細胞著絲粒核小體的結構與功能進一步復雜化.同時, DNA甲基化與組蛋白的共價修飾以及染色質重塑等, 為真核生物細胞的表觀遺傳信息傳遞起到了載體的作用.而在生命體的進化過程中, 這些經過共價修飾的組蛋白是如何嵌入核小體, 并在不同類型的染色質中形成結構和功能各異的核小體, 從而在生物體表觀遺傳過程中發揮非常重要功能的過程, 都值得深入研究.我們認為, 通過進一步的深入開展體內實驗, 研究異常的著絲?；蛉斯ぷ儺愔z粒的染色體如新著絲點\\(neocentromere\\)染色體、人工染色體\\(artificial chromosomes\\)和雙著絲點染色體chromosomes\\)等的結構與功能, 并結合高通量測序技術, 更好地闡釋CENP-A分子維持生物遺傳特性的獨特機制, 進而透徹理解著絲粒與染色質的精確結合, 在真核生物細胞的發育、表觀遺傳記憶、染色質重塑和基因表達調控等方面發揮重要作用的遺傳機制.同時, 拓展對更多的模式動植物物種的研究, 繼續對CENH3等關鍵性的表觀遺傳元件進行詳細解析, 可以在不久的將來為遺傳工程實現多種重要真核生物的人工染色體構建提供依據, 并使之在農業和醫學等領域得到廣泛應用.
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