自1992年發明以來，作為一種重要的篩選方法被用在微生物及遺傳學中的各個領域，這種篩選方法對微生物突變菌株，基因突變體等的篩選起到了很重要的作用，然而傳統影印培養法在使用過程中表現出使用的絲絨材料價格較貴、需反復滅菌和使用不便等缺點，為了使該方法操作簡便快捷可靠，不斷的出現改良的影印培養法。本文從傳統影印培養法到改良影印培養法在生物實驗中的應用予以綜述。
1 傳統影印培養法
1952年Lederberg發明了影印培養法，該方法是將原始菌落影印在一系列選擇性平板的相同位置上，用這種方法能夠篩選得到相同遺傳型的菌落，其過程是：把長有菌落的原始培養皿倒置于包有絨布（已滅菌）的木質圓柱（直徑略小于培養皿直徑）上，使平板上的菌落影印在絨布上，然后把這一“印章”上的菌落一一接種到不同的選擇性培養基平板上，待這些平板培養后，對各平板相同位置上的菌落作對比，就可篩選出所需的突變型菌株。圖1就是利用影印培養法證明E.coliK12自發地產生抗鏈霉素突變株的實驗示意圖。其方法是：首先把大量對鏈霉素敏感的E.
coliK12細胞涂布在不含鏈霉素的平板上，待其長出許多小菌落后，用影印法接種到不含鏈霉素的培養基平板上，然后再影印到含有鏈霉素的選擇性培養基平板上。影印的作用主要是保證三個平板上培養的菌落具有親緣性和菌落在平板上生長的位置保持嚴格的對應性。經培養后，在平板上有個別抗鏈霉素的菌落生長，對培養皿和進行比較，就能在平板的相應位置找出平板上生長的那幾個抗性菌落的“孿生兄弟”。然后把平板中對應位置上的菌落挑至不含鏈霉素的培養液中培養，然后再涂布在平板上，然后重復上述步驟。反復重復上述同一過程后，就只要在培養皿和中涂上越來越少的原菌液后，便可在平板上長出越來越多的抗性菌落，這樣便可得到完全純的抗性菌株群體。由此可知，在這個過程中，原始的鏈霉素敏感菌株只通過移種和選擇序列，也就是說在根本未接觸過任何一點鏈霉素的情況下，便可以篩選到抗鏈霉素的突變株。影印培養法實驗最初的設計是為證明微生物的抗藥性突變是自發的，與相應的環境因素無關，目前已被廣泛的應用在營養缺陷型的篩選及抗藥性菌株的篩選等研究工作中。
但是傳統影印培養法在實驗過程中有一定的缺陷，主要表現在以下四個方面：①不適合菌落密度大的平板。在影印過程中，原始菌落轉移至絲絨上時需要摁壓，菌落被壓平，菌落面積擴大，從而在子板上形成接近扁平樣的菌落。細菌密度高或者分布不均勻，就會造成菌落間的污染；②生長節奏不同，體積大小不同的菌落，影印效果不同。會出現污染或者篩選不到所需要的菌落等缺點；③平板上的邊緣和中央影印效果不同。邊緣部分比中央部分容易受力，所以邊緣部分比中央部分易于影印，因此為了照顧平板中央菌落的影印效果，容易造成邊緣菌落受壓過大，菌落變形的情況，尤其在第二次影印時表現明顯；④影印要求高質量的絲絨。價格比較昂貴，其次每次需要將絨布固定于圓柱面上，所以操作步驟復雜也增加了污染的可能性。
2 改良的平板影印工具
徐民俊等在對生產用釀酒酵母進行遺傳改良的實驗中，對傳統影印平板工具進行了改良，改良后的影印平板工具是將長度一樣的大量竹簽捆扎成與平皿內蓋直徑相近的捆，整平接觸菌落的面，然后將背面用膠粘于平皿內蓋，60℃烘干，滅菌待用（圖2）。影印時將該工具與細菌接觸的面朝上平放在超凈臺上，打開上蓋即可,如果需要反復使用該工具，可在第一次影印后，將影印的一面在75%乙醇中浸泡2min，輕輕甩去過多的無水乙醇，在超凈臺上吹干5min即可重復使用。也可以制備多套，統一滅菌。徐民俊等使用改良的影印平板工具進行3輪影印傳代后，順利地篩選出大規模的轉化子。該改良的平板影印工具與傳統平板影印方法有很大的區別，使影印操作更為簡便，減少了污染的可能性,并且影印效果清晰，可以達到與母板相同的生長狀況。
改良的影印平板工具具有三方面的優點：①材料經濟，工藝簡單，操作簡便，無需其他介質，降低了污染；②邊緣菌落和中央菌落影印效果幾乎相同，大菌落和小菌落影印效果也相同；③影印效果良好。影印時不會將菌落壓平，無論影印幾版，皆不會使菌落擴散，因此避免了菌落間的交叉污染。該工具也存在兩方面的缺點：①直徑大于2mm的菌落，將會導致一個母板菌落形成2個子板菌落。②由于材料是用竹簽制作的，滅菌多次之后竹簽會變的脆弱，所以使用時間不長，如果要批量生產，材料換成鋼鐵類則可長期使用。
3 低熔點瓊脂糖影印培養法
ShobhanaNatarajan等將傳統的影印培養法進行改良，用改良的低熔點瓊脂糖影印培養法簡單快速的轉移了哺乳動物細胞，然后用接種環挑取陽性克隆，篩選得到需要表型的細胞，這種轉移速度較快，大大地減少了培養和分離稀有表型所花費的時間。具體過程如圖3所示，細胞培養在直徑為10cm的培養皿中，長到肉眼可見≥1000個細胞時影印，每個平板的培養基是20ml3%的低熔點瓊脂糖冷卻到37℃后，和2.5ml10×濃縮生長培養基以及2.5ml的血清混合（終濃度為1×培養基和10%血清），培養后用PBS洗掉平板中的血清，并在室溫下向每個平板的細胞中添加1mL的Trypsin-EDTA，在顯微鏡下觀察平板，待每個克隆中均有一些細胞變圓時棄去胰蛋白酶，并用含有瓊脂糖的新鮮培養基（包含添加血清的生長培養基）培養10~15分鐘，使其在平板中繼續生長。一個無菌的V型小竹板插在瓊脂糖中作為參考標記，這個參考標記插入的位置在原始平板的底部，然后將這個平板反向影印在直徑為15cm的培養皿中，同時在第一個平板中加入生長培養基讓每個克?。ò蠖鄶档募毎┦Ｓ嗟募毎^續生長，接著將第二個直徑為10cm的平板中的瓊脂糖倒入10cm的培養皿中，克隆也隨著轉移，插入的參考標記隨后放在第二個平板中，用巴斯德吸管在瓊脂糖上戳眼來趕走培養基中的氣泡，為了使轉移的細胞粘附在培養皿中，將培養皿在37℃下孵育16~24小時。
此種改良方法應用在細胞轉移實驗中，比較新穎，在這種方法中用低熔點瓊脂糖來作為影印工具，這種工具可以隨培養基一起配置，減少了外面介質，因此減少了污染的可能性。其次，在此方法中可以利用瓊脂糖的低熔點性來控制影印，在溫度高的時候瓊脂糖溶解在培養基中，起到培養細胞的作用，溫度低時瓊脂糖凝固，作為固體介質進行影印。再次細胞培養時細胞都貼壁，用胰蛋白酶消化可以使細胞脫落，消化的程度可以控制脫落的濃度，到適合濃度時進行影印，最適合的細胞濃度為每個培養皿20~50個克隆時，可以減少克隆之間的交叉感染。
4 結語
自從1952年Lederberg發明了影印培養法以來，已經被廣泛的用在細菌和酵母遺傳學來篩選需要的表型，在細胞轉移和篩選方面用的較少，也能夠用抗體染色的方法來鑒定目的基因不同表達程度的克隆，篩選抗菌素，篩選抗菌活性強的肽，從環境中分離有益的微生物，在限制性溫度下來鑒定易感的克隆，或者根據應用和特殊表型的需要進行其它篩選，因此在生物實驗中具有重要的指導意義。本文從傳統的影印培養法技術到改良的影印培養技術，從應用此技術來篩選突變菌株到篩選需要表型的細胞進行探討，傳統影印培養技術的影印工具是絨布，徐民俊等改良的影印工具是扎成捆的牙簽，ShobhanaNatarajan等改良的影印工具是低熔點的瓊脂糖，并用滅菌的小竹板插入培養基中做標記，這幾種技術各有利弊，具體可以根據實驗需要來選用，也可以根據實驗自行進行改良。根據前面所述，發現在影印培養技術中克隆之間的污染是一個很重要的問題，解決此問題，實驗操作中注意事項是一方面，主要的方面還有克隆密度的大小，如果克隆密度太大，可能不適合用這種技術來篩選，因為影印之后克隆之間不能很好地分開，達不到篩選的作用，也可能會造成污染。影印培養中的參考標記的確定也很重要，如果標記不準確則會被誤選。原始平板和影印平板的直徑大小有一定的要求，要事先設計好，原始平板的直徑要比影印平板的直徑小，如果原始平板的直徑大于等于影印平板的直徑則不能進行影印。
參考文獻
［1］Lederberg J，Lederberg EM. Replica plating and indirect selectionof bacterial mutants［J].Bacteriol.1952，63:399~406.
［2］徐禎，徐慶妍，胡志鈺，等.平板影印與 AHBA 合成酶基因篩選用于安莎類抗生素產生菌的分離［J].廈門大學學報（自然科學版），2012，51（1）：107－111.
［3］Grunstein M，Hogness D S.Colony hybridization：a method for theisolation of cloned DNAs that contain a specific gene ［J].Proc NatlAcad Sci USA，1975，72（10）:3961－3965.
［4］Esko JD，Raetz C R.Replica plating and in situ enzymatic assay ofanimal cell colonies established on filter paper［J］. Proc Natl AcadSci USA，1978，75（3）:1190－1193.
［5］鄭幼霞，趙人俊，張益菜.慶豐鏈霉菌中 SQPI 質?？刂浦掠缘倪z傳證明［J］.遺傳學報，1982，9（1）:8-13.
［6］徐民俊，田小群，周世寧.一種改進的平板影印工具及其應用［J］.微生物學報，2008，48（5）:657-660.
［7］Shobhana Natarajan.Tracy T. Chow. Jerry W.Shay.Woodring E Wright，Replica plating of mammalian cells using low melt agarose［J］.Cytotechnology，2007，54:145-147.
