表達 CD5 抗原的 B 細胞即 B1a 細胞廣泛分布于小鼠胸腔和腹腔,也存在于脾臟中,約占其 B 細胞總量的 5%.這種細胞能夠產生多種多反應性及親和力低的自身抗體,并且能夠分泌具有免疫抑制作用的IL-10[1].TLR7受體是一種模式識別受體,能夠識別病原相關模式分子從而引發先天性免疫反應并起始獲得性免疫反應[2].已知 TLR7 激動劑能夠使 Naive B 細胞增殖及活化,且促進其產生趨化因子、造血生長因子以及其他細胞因子如 IL-6 和IL-10[3,4].重要的是,小鼠 B 細胞分泌的 IL-10 主要來自于 CD5+B 細胞[5-7].雖然激活 TLR7 能促進小鼠 B 細胞分泌 IL-10,但 TLR7 激動劑是否影響 B細胞表達 CD5 迄今尚無報道.為此,本文用 B220+磁珠從小鼠脾臟細胞中分選出 B 細胞,在體外用TLR7 激動劑處理,觀察 TLR7 激動劑對分泌 IL-10的 CD5+B 細胞的比例變化,并分析 TLR7 激動劑對于 B 細胞表達 CD5 的比例及其 MFI 的變化,以探討TLR7 通路活化對小鼠脾臟 B 細胞表達 CD5 的影響.
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實驗動物 SPF 級 C57 /B6 小鼠,購于南京大學模式動物研究所.
1. 1. 2 主要試劑與儀器 PE-anti-CD5、IL-10-APC、小鼠 B220+陽性選擇磁珠及其分離產品購自 Milte-nyi 公司; R848\\( TLR7 激動劑\\) 購自 Sigma 公司; 抑制劑 PDTC\\( NF-κB 抑制劑\\) 、SP600125\\( JNK 抑制劑\\) 、SB203580\\( p38 抑制劑\\) 以及 PD98059\\( ERK 抑制劑\\) 均購自碧云天公司; RPMI1640 與胎牛血清由Gibco 公司購得; 流式細胞儀為 BD FACS calibur 公司儀器.
1. 2 方法
1. 2. 1 B 細胞的分離純化 脫頸處死 B6 小鼠,放入 75%酒精 10 min,在超凈臺內取出小鼠脾臟置于無菌磷酸鹽緩沖液\\( PBS\\) 內,用 5 ml 一次性無菌注射器吸取無菌 PBS 反復吹打脾臟; 然后用濾網過濾,除去組織團塊.4℃,1 200 r/min 離心 5 min,去上清,按照 107脾臟細胞加入 1 ml 磁珠專用分離Buffer 重懸,然后加入 100 μl B220+磁珠,用移液槍混勻,4℃孵育 15 min,孵育過程中每 5 min 輕微震蕩混勻一次; 加入5 ml PBS 洗一次,4℃,1 200 r/min離心 5 min,去上清; 然后將沉淀混勻于 1 ml 磁珠分離 Buffer 中用 LS 磁珠分離柱進行陽選,即得到純化的小鼠脾臟 B 細胞.
1. 2. 2 細胞培養 將 B 細胞以為 5 × 105每孔的量接種于 96 孔培養板中,設置 3 個重復孔,于 37℃、5% CO2培養箱中培養.
1. 2. 3 添加抑制劑及激動劑 將分離純化的 B 細胞于 37℃、5%CO2培養箱中培養 30 min,然后在各個相應孔中加入以下濃度的 TLR7 通路抑制劑:
SP600125\\( JNK 抑制劑\\) 10 μmol / L、PDTC\\( NF-κB 抑制劑\\) 10 μmol/L、SB203580\\( P38 抑制劑\\) 10 μmol/L及 PD98059\\( ERK 抑制劑\\) 10 μmol/L 混勻后放置于培養箱培養 30 min 后分別每孔再加入1 μmol/LR848 后混勻培養.不需要加入抑制劑的實驗操作,直接在鋪板后 1 h 向每孔加入 1 μmol/L R848 后混勻培養.
1. 2. 4 流式細胞術檢測 B 細胞表面 CD5 及其內部IL-10 CD5 的檢測: 將各孔細胞轉移到流式管中,用 PBS 洗一遍細胞,4℃,1 200 r/min 離心 5 min,去除上清,加入 1 μl CD5-PE,于旋渦振蕩儀上混勻,4℃ 孵育 30 min,加入 200 μl PBS 重懸,上流式細胞儀進行檢測.
胞內 IL-10 的檢測: 1 200 r/min 離心 5 min,去除上清,直接加入 1 ml fixation 重懸細胞,室溫固定20 min,加入 2 ml PBS 洗滌一次,加入 1 ml perme-abilization 重懸細胞,4℃ 避光孵育 30 min,1 200 r /min 離心 5 min 去除上清,往每管各加入 1 μl IL-10-APC,震蕩混勻后于 4℃ 避光孵育 30 min,加入 1 mlpermeabilization 洗滌 2 次,最后加入 200 μl PBS,上機檢測.
1. 3 統計學分析 所有實驗數據均以 x-± s 來表示,用 Prism 5. 0 對實驗數據進行分析,兩組間數據采用 t 檢驗分析.P <0. 05 為差異具有顯著性.
2 結果
2. 1 TLR7 激動劑上調小鼠脾臟 B 細胞中 CD5+IL-10+B 細胞的比例 IL-10 在小鼠 B 細胞中主要是由 CD5+B 細胞分泌,為了確定 TLR7 激動劑能否上調 CD5+IL-10+B 細胞 的比例,我們在第 1 天用R848 刺激 B 細胞,并用流式細胞術連續檢測了 1 ~7 d B 細胞表達 CD5 和 IL-10 的動態變化.結果顯示,與對照組相比,R848 能夠以時間依賴性的方式持續性地上調 CD5+IL-10+B 細胞 的比例 \\( P <0. 01\\) ,而 CD5-IL-10+B 細胞的比例無變化\\( 圖 1\\) .
2. 2 TLR7 激動劑上調 B 細胞表達 CD5 在正常狀態下小鼠脾臟 B 細胞中 CD5+B 細胞的比例約為5% ,為了進一步驗證 TLR7 激動劑是否能夠促進 B細胞表達 CD5,我們用 R848 刺激 B 細胞并用流式細胞儀連續檢測了 1 ~7 d CD5+B 細胞比例和 CD5MFI 的變化.結果顯示,與對照組相比,R848 能夠以時間依賴性的方式顯著上調 B 細胞表達 CD5\\( 圖2A\\) ,并且 在第 7 天 CD5 的上調比例達到峰值27. 78% \\( P < 0. 001\\) .另外從第 1 天至第 4 天,CD5的 MFI 也呈現出顯著的持續上調\\( 圖 2B\\) .
2. 3 TLR7 下游通路均與 B 細胞表達 CD5 有關TLR7 下游有 JNK、P38、ERK 及 NF-κB 四條信號通路,為了進一步驗證 TLR7 主要通過哪條信號通路實現其對 CD5 表達的調控,我們預先用四條通路的阻斷劑分別處理 B 細胞1 h 后加入 R848 刺激劑,并用流式檢測 CD5 表達的抑制情況.結果顯示,R848顯著促進了 B 細胞上調表達 CD5,NF-κB 阻斷劑在第 1 天就顯示出其對 B 細胞表達 CD5 的顯著性抑制\\( P <0. 05\\) \\( 圖 3A\\) ,而四條通路阻斷劑在第 3 天均顯示出對 CD5 表達的顯著性抑制\\( P <0. 05\\) \\( 圖3B\\) .這些結果說明 TLR7 下游通路均可促進 B 細胞上調表達 CD5.
3 討論
小鼠 B 細胞分泌的 IL-10 主要來自于 CD5+B細胞[5-7].既然 TLR7 刺激能夠誘導 B 細胞產生 IL-10,那么 TLR7 通路的活化對于 B 細胞表達 CD5 是否有影響呢? 首先,我們研究發現 TLR7 激動劑能夠上調分泌 IL-10 的 CD5 陽性 B 細胞的比率,這與已報道的研究結果一致.一些研究指出 CD5+B 細胞自身比 CD5-B 細胞存活時間要長,且 B 細胞分泌的 IL-10 能夠維持人和小鼠 CD5+B 細胞的長期存活[8-10],這與我們發現在體外培養 7 d 后對照組CD5+B 細胞的比例也有所升高的現象是一致的.
2009 年,Garaud 等[11]通過轉染 CD5 基因于不表達 CD5 基因的 B 細胞系,發現這種 B 細胞分泌IL-10 的能力與 CD5 的表達成正相關; 隨后 Garaud等[12]發現表達 CD5 的 B 細胞中轉錄因子 NFAT2 和STAT3 的入核直接與 IL-10 在 B 細胞中的表達水平有關,即使在 CD5-B 細 胞 中轉染了 NFAT2 和STAT3 基因也不能讓該細胞表達 IL-10,說明 CD5通過控制轉錄因子 NFAT2 和 STAT3 的入核來控制IL-10 的表達.我們發現 TLR7 刺激能夠促進 IL-10的表達,提示 TLR7 通路有可能通過促進 CD5 的表達間接促進 B 細胞分泌 IL-10.
關于 CD5+B 細胞的來源一直存在爭議,目前有兩種假說: 一種假說叫種系假說,該假說認為 B1a細胞來源于胚胎或者出生后早期的前體細胞,而 B2細胞來源于不同的前體細胞.另一種假說則認為,CD5+B 和 CD5-B 細胞來源于同一種細胞前體,CD5+細胞是經過某些特殊的抗原刺激后發生了基因重排所形成的[13].早在 1991 年 Cong 等[14]在體外驗證: anti-IgM 能夠誘導常規 B 細表達 CD5.我們的研究發現 TLR7 通路的活化能夠促進脾臟 B 細胞上調 CD5 蛋白的表達,提示 TLR7 通路活化可能通過某些通路誘導常規 B 細胞表達 CD5.至于這種現象究竟是 TLR7 激動劑通過誘導常規 B 細胞表達 CD5,還是激動劑對本來存在的 CD5+B 細胞作用所致有待通過分選 CD5 陽性和陰性的 B 細胞進行驗證.不管 CD5+B 細胞的來源到底屬于哪種 假說,CD5+B 細胞本身具有很強的自我更新能力,雖然目前其自我更新機制尚未明了,但是在正常生理狀態下 CD5+B 細胞的數量受到了嚴格的控制,在新生小鼠脾臟內 CD5+B 細胞 的比例為 30% ~40% ,2 周后其比例約為 5% 左右[15].最新研究指出 B1 細胞表面存在大量的小鼠唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素 G\\( Siglec-G\\) ,這種凝集素可能對控制 CD5+B 細胞的數量至關重要[16,17].還有研究表明 CD5+B 細胞數量或者功能的異常出現在多種自身免疫性疾病如類風濕性關節炎、系統性特發性血小板減少性紫癜\\( ITP\\) 以及慢性 B 淋巴細胞白血病中[18].
綜上所述,TLR7 激動劑能夠顯著上調 CD5+IL-10+B 細胞的比例; 并且能夠促進脾臟 B 細胞高表達 B 細胞表面分子 CD5; 進一步,TLR7 下游 NF-κB、P38、ERK 及 JNK 通路的活化均能促進 B 細胞表達CD5.這些結果說明 TLR7 刺激直接影響小鼠 B 細胞中 CD5 的表達,進而影響其 IL-10 的分泌等功能.
提示 TLR7 改變 CD5+IL-10+B 細胞的比例可能參與自身免疫性疾病進程.
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