神經元是構成大腦神經系統網絡功能的基本單位，不同神經元之間相互作用的集合構成了有各種高級功能的復雜神經網絡，原鈣粘蛋白可能在復雜神經網絡形成中起到關鍵作用。神經元細胞膜表面蛋白的選擇性表達能夠產生單個神經元表面分子的多樣性，該多樣性能夠使神經元聯系具有特異性，即自我識別或自我回避。原鈣粘蛋白家族作為鈣粘蛋白超家族中的成員，是一類依賴鈣離子的細胞表面粘著蛋白，在神經發育中扮演重要作用。原鈣粘蛋白基因家族包含3 個緊密相連的基因簇：Pcdhα 簇 、Pcdhβ 簇和Pcdhγ 簇，在哺乳動物中高度保守。人類Pcdhγ基因簇由 22 個可變第一個外顯子和下游 3 個恒定的外顯子組成，單個可變第一個外顯子剪接到下游 3 個恒定的外顯子可產生 1 種信使 RNA 分子，不同的神經細胞對可變第一個外顯子上游啟動子的選擇性表達產生了神經元表面的分子多樣性。

DNA 調 節 元 件 與 DNA 酶 超 敏 位 點 HSs（DNase I hypersensitive sites）密不可分，因為 HSs區域有調節因子結合，導致核小體重建或缺失，繼而該區域的 DNA 序列容易被 DNA 酶降解。真核生物的基因組在調節因子介導的遠距離相互作用下形成復雜而高度有序的染色質結構。絕緣子CTCF（CCCTC-binding factor）在其中扮演著組織者的角色。先前研究發現 Pcdhγ 每個可變第一個外顯子的啟動子（除 γc4、γc5 外）都含 1 個保守序列元件，即 CTCF 結合位點，且 CTCF 可以影響 Pcdhγ 啟動子的活性。染色質免疫共沉淀結合二代測序技術揭示了兩個候選的調控元件,即 HS7L 和 HS5-1aL,但其調控功能還有待確認。本研究通過分子克隆、熒光素酶報告基因和基因沉默試驗，證實了 HS7L 和 HS5-1aL 對Pcdhγ 啟動子活性的增強作用，并探討了絕緣子CTCF 對 Pcdhγ 基因表達的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株
人胚胎腎細胞系 293T、人神經母細胞瘤細胞系 SK-N-SH 購自上海細胞庫。

1.2 主要試劑
螢火蟲熒光素酶報告載體 pGL3-Control（E1741）和 pGL3-basic（E1751）、海腎熒光素酶內參載體 pRL-TK（E2241）、pGEM誖-T Easy VectorSystem（IA1360）、雙熒光素酶檢測試劑盒（E2940）和反轉錄試劑盒（A3500） 購自美國 Promega 公司；FastStart Universal SYBR Green Master 試劑（04913914001） 購 自 瑞 士 羅 氏 公 司 ；Lipofec－tamineTM2000（11668-019）購自美國 Invitrogen 公司；KOD-Plus（KOD-201）購自日本 TOYOBO 公司；限制性內切酶 KpnⅠ （R0142S）、HindⅢ（R0104S）、EcoR Ⅰ （R0101S）、Sac Ⅰ（R0156V）、XbaⅠ（R0145S）、SalⅠ（R0138S）和 T4 DNA 連接酶（M0202L）購自美國 New England Biolabs 公司；基因組 DNA 純化試劑盒 （A1120） 購自美國Promega 公司；FBS（10099 -141）、DMEM（10313 -021）購自美國 Gibco 公司。

1.3 儀器
PCR 儀（美國 Applied Biosystems 公司），Ep－pendorf 5415D 離心機（德國 Eppendorf 公司），電泳系統（美國 Bio-Rad 公司），CO2細胞培養箱（美國 Thermo 公司），Synergy 2 多功能酶標儀（美國BioTek 公司），ChemiDoc XRS+ 系統 \\(美國 Bio-Rad 公司\\)。

1.4 方法

1.4.1 序列比對分析人基因組 DNA 序列信息從 網站獲取。序列同源分析結果通過 Vista 軟件得出。

1.4.2 熒光素酶報告系統中質粒的構建
經 PCR \\(pGL3F 和 pGL3R 為引物\\)將 EcoRⅠ、XhoⅠ、MluⅠ和 SacⅠ酶切位點序列引入 pGL3-Basic 質粒。以從 HEC-1-B 細胞系中提取的人基因組 DNA 為模板，使用表 1 所列引物,通過 PCR擴增 γa9（γa9F 和 γa9R）、γa10（γa10F 和 γa10R）、γb3 （γb3F 和 γb3R）、γb7 （γb7F 和 γb7R）、γc3（γc3F 和 γc3R）、γb1\\(γb1F 和 γb1R\\)的啟動子序列以及 HS7L（HS7LF 和 HS7LR）和 HS5-1aL（HS5-1aLF 和 HS5-1aLR）調控元件序列。將 PCR 擴增的各啟動子序列經 KpnⅠ和 HindⅢ雙酶切后，插入 pGL3-Basic 載體的 KpnⅠ和 HindⅢ酶切位點之間，即獲得 pGL3-γa9-luc、pGL3-γa10-luc、pGL3-γb3-luc、pGL3-γb7 -luc、pGL3 -γc3 -luc 和pGL3-γb1-luc 質粒。將 HS7L 或 HS5-1aL 元件分別插入 pGL3-γa9-luc、pGL3-γa10 -luc、pGL3-γb3-luc、pGL3-γb7-luc 和 pGL3-γc3-luc 質粒的EcoRⅠ和 SalⅠ限制性內切酶識別位點之間，即獲得 pGL3-γa9-luc-HS7L/HS5-1aL、pGL3-γa10-luc -HS7L/HS5 -1aL、pGL3 -γb3 -luc -HS7L/HS5 -1aL、pGL3-γb7-luc-HS7L/HS5-1aL 和 pGL3-γc3-luc-HS7L/HS5-1aL 質粒。上述克隆均經 Sanger 測序確定其正確性?！颈?】

1.4.3 雙熒光素酶報告基因活性測定
雙熒光素酶報告基因活性測定采用美國Promega 公司 Dual-Glo 熒光素酶報告基因檢測系統。293T 細胞的培養使用含 10%胎牛血清的DMEM 高糖培養液（含 100 kU/L 青霉素和 100 kU/L鏈霉素）。以 293T 細胞轉染為例，轉染前細胞按照 3×104個/孔接種于 96 孔板。轉染使用 Lipo－fectamine 2000 試劑，每孔轉染 37 fmol 質粒 DNA（不足 200 ng 用 pGEM-T Easy 質粒補齊），10 ng內參 pRL-TK 與 25 μL DMEM 無血清培養基混合，記為 A 液；然后，將 0.4 μL 脂質體與 25 μL DMEM無血清培養基混合，記為 B 液，室溫放置 5 min。

最后，將 A 液和 B 液 1:1 混合，室溫放置 20 min后，加入 96 孔板中。293T 細胞轉染 48 h 后，棄去培養液，每孔加入 50 μL 裂解液，螢火蟲熒光素酶底物反應 10 min 后，吸取 40 μL 孔細胞轉移至白色不透光 96 孔板中，在 Synergy 2 多功能酶標儀中測得每個孔的螢火蟲熒光素酶發光值。然后往孔內加入 20 μL 孔螢火蟲熒光素酶的淬滅劑以及海腎熒光素酶的底物，反應 10 min，再測得每個孔的海腎熒光素酶的發光值。數據表述為螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶的數值。每個實驗至少重復 3 次。SK-N-SH 細胞中的雙熒光素酶報告基因活性測定試驗與此類似，不再贅述。

1.4.4 慢病毒包裝與感染
采用Lipofectamine2000試劑，將CTCF shRNA質?；?GFP shRNA 質粒與包裝質粒 pPax2 和pMD2.G共轉染293T細胞，轉染18h后更換病毒收集培養基（含 10%胎牛血清，11 g/L BSA，100 kU/L 青霉素和 100 kU/L 鏈霉素）分別于轉染后 42 h 和 66 h收集含病毒顆粒上清，經離心、過濾后分裝存放于-80 ℃冰箱。SK-N-SH 細胞感染時添加 8 μg/mLpolybrene \\(Sigma\\)，感染第 3 d 后添加 2 μg/mLPuromycin \\(Sigma\\),每 2 d 更換一次培養液。

1.4.5 實時定量 PCR
細胞經 TRIzol 試劑裂解并提取 RNA，取 1 μgRNA，經美國 Promega 公司 AMV 試劑逆轉錄,實時定量 PCR 檢測采用瑞士 Roche 公司 FastStartUniversal SYBR Green Master 試劑在 ABI 7500 定量 PCR 儀中進行。實時定量 PCR 引物采用Primer 5 引物設計軟件設計，GAPDH 基因作為內參\\(引物見表 2\\)?！颈?】


1.4.6 蛋白免疫印跡
蛋白免疫印跡實驗采用 Millipore CTCF 抗體作為一抗，經 4 ℃孵育過夜后，與羊抗兔二抗孵育1 h，圖像采集使用 ChemiDoc XRS+ 系統 \\(Bio-Rad\\)。

1.4.7 統計學處理
采用 SPSS 軟件進行 t 檢驗分析，n=3，t 值檢驗后，*P<0.05 為有顯著性差異；**P<0.01 為有極顯著性差異。

2 結果

2.1 調控元件 HS7L 和 HS5-1aL 的序列保守性分析
基因組調控元件（如增強子和基因座控制區）在不同的物種中具有高度保守性。本文對人和鼠的 Pcdhγ基因簇下游序列進行了 Vista 分析。圖1 中，橫坐標代表序列在基因組中的位置，縱坐標代表人與鼠的序列相似性程度?？梢?，人與鼠的Pcdhγ基因簇除了外顯子的序列保守外，內含子及基因間序列同樣具有高度的序列相似性。DNA 酶超敏位點 HS16、HS5-1bL/HS17、HS18、HS19-20能夠順式激活 Pcdhβ 基因簇的表達，且這些位點的缺失能夠非均一地部分降低 Pcdhγ 亞型的表達?！緢D1】

調控元件 HS7L 和 HS5-1aL 作為候選的增強子可能具有調控 Pcdhγ 基因表達的作用。

2.2 HS7L 對 Pcdhγ 啟動子活性的影響
為研究 HS7L 是否影響 Pcdhγ 的啟動子活性，將克隆并測序正確的重組質粒（圖 2 左）與pGEM-T Easy 載體，內參載體質粒 pRL-TK 瞬時轉染 293T 細胞后,再分別測出螢光蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，用二者的比值大小衡量Pcdhγ 啟動子活性強弱。實驗結果顯示：陰性對照質粒中加入 HS7L 序列后顯著提高了 γa9、γa10、γb3、γb7 和 γc3 的啟動子活性（圖 2 右）。該結果表明，DNA 超敏位點 HS7L 具有增強 Pcdhγ 啟動子活性的作用?！緢D2】


2.3 HS5-1aL 對 Pcdhγ 啟動子活性的影響為
了探究 HS5-1aL 對 Pcdhγ 的啟動子活性的影響，構建雙熒光素酶報告系統（圖 3 左）并轉染 293T 細胞，檢測雙熒光素酶的活性。結果顯示HS5-1aL 對 γa10 有顯著的增強作用，但對其他啟動子無顯著影響（圖 3 右）。該結果表明，DNA 超敏位點 HS5-1aL 具有增強部分 Pcdhγ 啟動子活性的作用?！緢D3】

2.4 CTCF 基因沉默對 Pcdhγ 基因表達和啟動子活性的影響
以慢病毒作為載體，通過 shRNA 下調 CTCF后，從 SK-N-SH 細胞中提取蛋白進行蛋白免疫印跡檢測，結果顯示該 shRNA 能夠有效降低CTCF 蛋白表達（圖 4A）。CTCF 分別下調 5 d 和 9 d后，從 SK-N-SH 細胞中提取總 RNA，經反轉錄進行實時定量 PCR 分析，發現 γb1 基因表達在下調第 5 d 增加，在下調第 9 d 降低（圖 4B），γc3 無顯著性變化（圖 4C）。CTCF 下調 5 d 后瞬時轉染含γb1 或 γc3 啟動子的雙熒光素酶報告基因質粒，發現 γb1 啟動子活性顯著降低，γc3 無顯著性變化（圖 4D）。該結果表明，CTCF 對于維持 γb1 基因表達和啟動子活性至關重要，調控元件 HS7L 和HS5-1aL 以及已報道的其他下游調控元件可能通過 CTCF 介導的增強子-啟動子相互作用調控Pcdhγ 表達?！緢D4】


3 討論

人腦中包含超過 1 000 億個神經元細胞，這些細胞之間互相聯系形成約 150 萬億個特異的突觸連接，原鈣粘蛋白基因簇可能在大腦復雜神經元連接中起到重要作用。如此龐大的相互作用網絡需要大量的細胞表面分子用以“自我識別”，使神經元能夠“自我回避”。最近研究發現，Pcdh 在實現神經元的“自我回避”中發揮至關重要的作用，Pcdh 是目前脊椎動物中唯一被發現參與該功能的基因。Pcdh 能夠通過啟動子選擇性表達產生巨大的分子多樣性，該啟動子的選擇被認為是通過增強子-啟動子的相互作用得以實現的。但是目前，Pcdh 的增強子調控元件還未被完全確定。

本文對 Pcdhγ 的增強子調控元件的研究對于探索Pcdhγ 如何實現多樣性表達的分子機制至關重要。

已有的研究鑒定了 Pcdhγ 下游調控元件HS16、HS5-1bL/HS17、HS18 和 HS19-20，但是基因敲除這些元件幾乎完全沉默 Pcdhβ 基因，只能非均一地部分降低 Pcdhγ 基因的表達。我們實驗室先前發現 Pcdhγ 下游調控元件 HS7L 和 HS5-1aL 具有增強子特性，即富集RNA 聚合酶Ⅱ。因此，有必要進一步對該兩個調控元件做進一步研究。報告基因是現代分子生物學中用于分析順式元件與反式作用因子相互作用關系的一種重要工具。本研究通過分子克隆，將調控元件 HS7L 和HS5-1aL 分別克隆至包含 γa9、γa10、γb3、γb7 和γc3 啟動子的熒光素酶報告基因的下游。通過熒光素酶報告基因試驗檢測其對該 5 種 Pcdhγ 啟動子活性的影響，發現 HS7L 對 5 種啟動子活性都具有增強作用，而 HS5-1aL 僅對 γa10 啟動子活性具有增強作用。這些結果表明，DNA 超敏位點 HS7L和 HS5-1aL 具有增強 Pcdhγ 啟動子活性的作用。

CTCF 是真核生物中進化上高度保守的鋅指蛋白，具有轉錄激活、抑制、絕緣子、印跡、X 染色體失活、介導形成高度有序的染色質構象以及招募 RNA 聚合酶的功能。先前報道發現：除了αc2、β1、γc4、γc5 之外，原鈣粘蛋白其他基因的啟動子都包含一個 CTCF 識別位點。CTCF 通過結合原鈣粘蛋白 α 基因簇中的啟動子和增強子，介導二者的相互作用，形成基因表達中樞，從而實現啟動子的選擇。因此，CTCF 可能也通過介導增強子-啟動子相互作用調控 Pcdhγ 表達。本研究通過基因沉默轉錄因子 CTCF，發現下調 CTCF 不僅降低 γb1 基因表達且能夠顯著降低 γb1 啟動子報告基因活性。該結果表明，CTCF 對于維持 γb1基因表達和啟動子活性至關重要，調控元件 HS7L和 HS5-1aL 以及已報道的其他下游調控元件可能通過 CTCF 介導的增強子-啟動子相互作用調控 Pcdhγ 表達。該結果為進一步研究 Pcdhγ 基因表達調控機制奠定了基礎。