肝素\\(Heparin,HP\\)因其在肝中大量存在而得名,是一類長鏈糖胺聚糖,由硫酸化的葡萄糖胺和己糖醛酸以β-1,4糖苷鍵交叉連接組合而成.肝素在機體內能與多種蛋白質相互作用而具有多種生物功能,如抗凝血、抗炎和抑制腫瘤轉移等.肝素分子量為3 000~50 000道爾頓,僅低分子的1/3部分有較強的抗凝作用.為此,近年國內外對低分子肝素的開發十分重視,希望通過化學降解或酶解的方法將肝素降解成平均分子量在4 000~6 500道爾頓的低分子量肝素\\(low molecular weight heparin,LMWH\\),由于其分子量較小,不易被血小板第Ⅳ因子中和,增強了抗凝效果和纖溶作用,同時抗血小板、誘發出血的副作用大大減少,幾乎對脂質的代謝沒有影響,因而倍受臨床青睞.目前廣泛用于心血管疾病和血液透析.

肝素酶\\(heparinases\\)是多糖裂解酶,作用于肝素或者硫酸乙酰肝素\\(heparan sulfate\\),可以將大分子肝素降解成低分子量肝素,由Payza等在肝素黃桿菌\\(Flavobacterium heparinum\\)中首次發現.此后,人們對肝素酶以及肝素酶生產菌作了廣泛的研究.目前已從肝素黃桿菌中發現3種肝素酶:HepI、HepII和HepIII.LMWH的生產通常有化學裂解法和酶法.酶法生產LMWH具有低能耗、無污染、安全性高的優點,但也存在成本過高的缺點,主要是野生菌生產肝素酶的產量極低,而且需要價格昂貴的肝素誘導,由此導致其在生產上的使用受到較大的限制,因此如何獲得廉價的肝素酶用于生產就成為酶法制備LMWH的關鍵.肝素酶I的異源重組表達是替代肝素黃桿菌生產肝素酶I的有效可行方案,對肝素酶基因進行克隆表達對解決這些問題并進一步探討肝素酶的性質具有重要意義.

本文將HepI基因克隆到原核表達載體pGEX-4T-2中,并轉化到大腸桿菌BL 21菌株中,通過IPTG誘導基因工程菌獲得HepI酶蛋白,并對誘導與表達條件進行優化,為通過生物工程方法獲得HepI酶蛋白奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料
肝素黃桿菌\\(F.heparinum\\),表達質粒pGEX-4T-2;大腸桿菌BL21菌株由本實驗室保存;PfuTaq酶、dNTP、Sma I酶、Not I酶、T4DNA連接酶、蛋白質標準marker購自Ferments,DNA marker購自上海生工,其他試劑均為 國產分 析純.肝 素酶HepI的PCR引 物1:5’AACCCGGGATGAAAAAA-CAAATTCTATA 3’\\(Sma I\\),引物2:5’AAGCGGCCGCCTATCTGGCAGTTTCGCTGT 3’\\(Not I\\)由生工上海有限公司合成.

1.2 方法
1.2.1 HepI基因的克隆取20μL肝素黃桿菌培養液到Ep管中,99℃裂解10min,10,000×g離心5min,取上清液1.0μL作為PCR擴增的模板,同時在PCR管中加入PfuTaq酶0.2~0.3μL,Buffer2μL,dNTPs 1.0μL,引物1和 引物2各1.0μL,H2O 14μL,反應總體積20μL,PCR擴增條件為:先94℃預變性3min,然后94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸70s,共38個循環,最后72℃繼續延伸10min.

1.2.2 HepI基因的重組將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,切膠回收目的基因.取目的基因DNA約1.0μg用Sma I,Not I酶切,取pGEX-4T-2質粒DNA約1.0μg用Sma I,Not I酶切,然后回收酶切產物,取酶切過的目的基因DNA 200ng和質粒DNA 80ng在24 ℃下用T4DNA連接酶連接30min,用連接產物轉化大腸桿菌BL21感受態細胞,涂布到LB固體培養基平板上\\(含氨芐青霉素\\)培養16h,挑取10個菌落,通過菌落PCR方法挑選陽性克隆,PCR條件同上.選取陽性克隆培養5mL菌液,提取質粒,通過雙酶切法進一步檢測,陽性菌落送生工測序.

1.2.3 HepI基因的誘導表達將測序正確的菌株接種到5mL含氨芐青霉素的LB液體培養基中,37℃下振蕩培養過夜,第二天按1∶50的比例接種到新鮮的培養基中培養至生長對數期\\(約4h\\)后取出,放至室溫后加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半苷\\(IPTG\\),誘導劑的終濃度為0.25mmol/L的,然后將不同的菌液分別在不同溫度下繼續搖培4~6h進行目基因的誘導表達.離心法收集菌體,菌體用冰冷的PBS重懸,超聲破碎裂解細菌,10 000×g離心10min,對離心后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析.

1.2.4 HepI重組蛋白的純化將含重組質粒的BL21菌按1∶50的比例接種于500mL LB液體培養基,搖培4h后取出冰浴10min,然后加入IPTG,在12℃繼續搖培10h.離心法收集細菌,加入預冷的15mL 1×PBS緩沖液懸浮細菌,冰上超聲裂解細菌.裂解液4℃下10 000×g離心20min,將離心后的上清液與Glutathione Sepharose 4B結合30min,將結合液裝到層析柱上,用1×PBS洗去雜蛋白,然后用洗脫緩沖液\\(50mmol/L Tris-HCl,10mmol/L GSH,pH 8.0\\)洗脫目的蛋白.通過SDS-PAGE法鑒定融合蛋白的純度,用Bradford法測定蛋白質濃度.

2 結果與分析
2.1 HepI基因的克隆與表達從NCBI獲得HepI基因的DNA序列,以肝素黃桿菌的DNA為模板,用HepI基因的特異性引物擴增目的基因,擴增產物通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,可以在凝膠上看到1 000bp左右的條帶,與預想的PCR產物大小相符合\\(圖1\\).PCR產物經常規的操作步驟,構建出重組質粒pGEX-4T-2-HepI,然后轉化大腸桿菌E.coli BL21感受態細胞,菌落PCR擴增出1 000bp大小的特異性條帶.【圖1】

對該重組表達質粒進行雙酶切鑒定,也得到一條長約1000bp的條帶,與預期大小一致\\(圖2\\),說明HepI基因已克隆到表達載體上,對酶切鑒定正確的陽性克隆進行測序,使用DNAMAN軟件比較此次克隆到的序列和NCBI上的序列,結果表明序列正確,沒有移碼或突變,表明原核表達載體成功構建.重組菌用IPTG誘導,SDS-PAGE電泳結果表明,經IPTG誘導后,重組菌出現一條非常明顯的誘導蛋白條帶,條帶大小在58U\\(圖3\\),此帶的大小與肝素酶HepI蛋白\\(約30U\\)及與其融合的GST蛋白的分子量\\(28U\\)之和大致相當.【圖2-3】

但在對照組\\(未經IPTG誘導的重組菌株\\)中看不到該蛋白條帶,說明HepI基因插入表達載體pGEX-4T-2后,在大腸桿菌中獲得了高效表達,但在37 ℃下誘導形成不可溶的包涵體.改變誘導溫度,經過不同溫度的多次嘗試,發現融合蛋白在12℃條件下部分可溶.

通過誘導溫度的試驗,我們選擇12℃作為肝素酶的誘導溫度,重組菌經IPTG誘導12h后離心收集菌體,超聲波破碎,Glutathione Sepharose 4B親和層析純化.

純化的重組蛋白進行SDS-PAGE分析以鑒定其純度,結果在凝膠上只有一條58U大小的條帶,說明獲得了較高純度的重組融合蛋白\\(圖4\\).【圖4】


3 結論

通過本研究,我們獲得了表達肝素酶HepI的基因工程菌,并對肝素酶的表達條件進行了初步優化,采用親和層析方法,獲得了重組表達的融合酶蛋白,為肝素酶的應用研究打下了較好的基礎,同時為開展重組酶蛋白降解肝素的活性與降解條件研究創造了條件.