MicroRNA\\(miRNA\\)是廣泛存在于真核生物中的一類具有調控功能的非編碼 RNA，通過互補或不完全互補的方式識別并結合靶基因引導沉默復合體，使靶基因 mRNA 降解或調控其蛋白翻譯，從而在轉錄后水平影響基因和\\(或\\)蛋白的表達。近年來研究證實，miRNA 的調節紊亂與一些腫瘤的發生密切相關，并且許多 miRNAs 調控位點位于與細胞癌變密切相關的細胞周期調控因子基因、癌基因或抑癌基因上，這對于癌癥病因學的研究具有重要意義。
我們將 Ambion 公司開發的人類成熟的miRNA庫分別轉染到常用的胃癌 AGS 細胞，通過 Alamarblue 測定 AGS 細胞的增殖，篩選并確定對 AGS 細胞增殖有顯著抑制作用的 miRNA。經過大規模的篩選后發現 miRNA-491-5p 明顯抑制 AGS 細胞增殖。研究報道 miRNA-491-5p 可通過影響間質金屬蛋白酶 9 的表達在多形性膠質母細胞瘤發揮作用。另外，miRNA-491-5p 對口腔鱗狀細胞癌的細胞侵襲有作用。MiRNA-491-5p 在胃癌細胞中具體的作用機制還不明了。為了繼續進行其功能研究，本研究擬構建miRNA -491 -5p的慢病毒過表達載體， 轉染HEK293T 細胞，應用實時熒光定量 PCR 檢測轉染細胞中 miRNA-491-5p 的表達量，以判斷慢病毒載體過表達 miRNA-491-5p 的程度。接著將其包裝成病毒顆粒，進一步感染胃癌 AGS 細胞，篩選 miRNA-491-5p 穩定表達細胞株。
1、材料與方法
1.1 材料
AGS 細胞、HEK293T 細胞、胃癌細胞的基因組、E. coli Top10 \\(由本實驗室保存\\)，1640 培養基、胎牛血清\\(Gibco 公司\\)，慢病毒表達質粒 PCDH-511B \\( SBI 公 司 \\) ，ViraPowerTMLentiviral PackagingMix、M-MLV 逆轉錄酶 \\( Invitrogen 公司 \\) ，限制性內切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和 DNA Marker\\(Fermentas公司\\)，DNA 片段快速回收 Kit、質粒抽提試劑盒\\(Axygen 公司\\)，胰蛋白酶\\(Sigma 公司\\)，FastStart Uni－versal SYBR Green \\(ROX\\)\\(Roche 公司\\)，Prime STAR高保真 DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶\\(TAKARA公司\\)。
1.2 方法
1.2.1 PCDH-511B-miRNA-491-5p 載體構建 在UCSC中查詢獲得人的 miR－NA-491-5p 基因序列，用 Primer 6.0 設計獲得上游引物 5’-CCGgaattcTTTCTGGGTAGCCTTTAGC-3’和下 游 引 物 5’-CGCggatccTCAAATAGCCATCCTA－CACT-3’。如小寫字母所示，寡核苷酸序列兩端分別加上 EcoR Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切位點。PCR 反應體系及參數為：10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP2.0 μL、25 mmol/L MgCl21.0 μL、10 μmol/L 上游引物 0.5 μL、10 μmol/L 下游引物 0.5 μL、胃癌細胞的基因組 0.3 μL、Prime STAR 高保真 DNA 聚合酶0.3 μL、補足 ddH2O 至 25 μL；PCR 條件為 95 ℃預變性 5 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；35 個循環；72 ℃延伸 10 min。將 PCDH-511B 載體與 PCR產物進行雙酶切，純化后連接。然后轉化 E.coliTop10，涂布卡納抗性的 LB 平板，37 ℃過夜培養。重組質粒經過雙酶切鑒定，PCR 擴增鑒定后送交南京金斯瑞生物有限公司進行測序。
1.2.2 實時熒光定量 PCR 檢測 PCDH -511B -miRNA-491-5p 載體過表達 miRNA-491-5p 的程度 將重組質粒 PCDH-511B-miRNA-491-5p 與 PCDH-511B 空質粒通過 LipofectamineTM2000\\(Invitrogen 公司\\)分別轉染到 HEK293T 細胞，48 h 后吸掉舊培養基，接著用常規 Trizol 試劑\\(Invitrogen 公司\\)抽提總RNA，DEPC 水溶解沉淀，核酸蛋白分析儀\\(Beckman Coul－ter，USA\\)測定 RNA 濃度，根據 RNA 在 A260/A280≥1.8及甲醛變性凝膠電泳 28 S、18 S RNA 條帶比值≥1.5鑒定 RNA 純度及完整性。取總 RNA 1 μg 加入無菌蒸餾水 12 μL，混勻后 72 ℃孵育 5 min，隨即置于冰上；在另一去 RNase 的 PCR 管中配置以下反應液：dNTP mixture 2.0 μL、Rnase 抑制劑 0.5 μL、miR－NA-491-5p 逆轉錄引物0.5 μL、RNU6B 逆轉錄引物0.5 μL、5 ×buffer 4.0 μL、M -MLV 逆轉錄酶 0.5 μL\\(Invitrogen 公司\\)；與總 RNA 的溶液混勻，42 ℃孵育60 min，所得 cDNA 置于-20 ℃保存。構建 miRNA-491 -5p 和 RNU6B 的 Real time -PCR 反應體系：cDNA 5.0 μL、Primers 1.0 μL、SYBR Green Ⅰ熒光染料 10 μL、無菌蒸餾水 8.0 μL；反應條件：95 ℃預變性 10 min；95 ℃ 15 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共 40 個循環；循環結束后72 ℃延伸 10 min，每個標本均作復管 PCR 反應，至少重復 3 次\\(PCR 儀采用 ABI 7500\\)。
采用 RNU6B 作為內參照，用 RNU6B 的拷貝數作為校正基數，通過 LightCycle 軟件直接獲得各樣本中 miRNA-491-5p 的 Ct\\(cycle threshold\\)值，與同樣本中 RNU6B 的 Ct 值相減，即獲得該樣本中 miR－NA-491-5p 的 ΔCt 值；由于以 Real time-PCR 來檢測 RNA 時，受到不同 RNA 樣本存在不同的逆轉錄\\(RT\\)效率的限制，用正常 HEK293T 細胞的 ΔCt 值作為校正抽提 RNA 進行定量 PCR 檢測，得出-ΔΔCt值，按目的基因表達量=2-ΔΔCt公式計算各樣本中miRNA-491-5p 的相對表達量。
1.2.3 包裝 PCDH-511B-miRNA-491-5p 病毒顆粒HEK293T 細胞常規培養于 10 cm 細胞培養皿，并采用含 100 mL/L 胎牛血清的 1640 培養液，置于 37 ℃的 CO2培養箱中培養。2~3 d 換 1 次培養液。PCDH-511B-miRNA-491-5p 重組質粒載體和空載體質粒與病毒包裝系統\\(ViraPowerTMLentiviral PackagingMix\\)共同轉染 293T 細胞，第 4 或第 5 天收集上清液，離心\\(5 000 r/min 5 min，RT\\)，0.45 μm 的濾器過濾。收獲的病毒液 26 000 r/min，2 h 4 ℃離心后棄去上清濃縮，再用適量不含血清的培養基或 PBS、1%BSA 重懸病毒，-80 ℃儲存備用。
1.2.4 篩選 miRNA-491-5p 的穩定表達細胞株 接種 2×105AGS 細胞到 6 孔板，使其過夜后能融合至30%~50%；加入不同梯度的病毒—1640 混合物，設6 個梯度，按×10-1、×10-2、×10-3、×10-4、×10-5、×10-6進行系列稀釋；37 ℃、5%的 CO2培養箱中培養過夜；第3 天更換新鮮的 1 640 培養基；感染后 3～4 d，熒光顯微鏡下觀察各孔中綠色熒光蛋白\\(green fluorescentprotien，GFP\\)的熒光表達情況。每毫升病毒原液含有具感染能力的病毒顆粒的個數=GFP 陽性細胞個數×稀釋倍數。接著將感染過的細胞傳代，并在 24 孔板內以\\(5~8\\)×104cells/孔的密度鋪板，孵育過夜后，吸除舊的培養基，然后加入含有適量濃度\\(由殺滅曲線確定\\)的puromycin\\(嘌呤霉素\\)的新鮮培養基，每 2~3 d替換新鮮配制的篩選培養基；每天檢測細胞并觀察活細胞生長比例，以及 GFP 表達的水平及所占比例。大約 2 周后篩選出穩定的細胞株。
2、結果
2.1 PCR 擴增人 miRNA-491-5p 基因 以 AGS 胃癌細胞基因組為模板，克隆 miRNA-491-5p 基因，產物大小約為 460 bp，這與理論估計相一致\\(圖 1\\)。
PCDH-511B-miRNA-491-5p 重組質粒的構建見圖2。對 PCR 產物和 PCDH-511B-miRNA-491-5p 載體進行雙酶切、凝膠回收后按 T4 連接酶說明書上的體系連接。轉化后挑取酶切鑒定為陽性的單克隆送交南京金斯瑞生物科技有限公司測序，確保目的片段正確性。測序結果證實所得到的片段與 miRNA-491-5p 基因序列相一致，可以用于后續研究。2.2 實時熒光定量 PCR 檢測 PCDH-511B-miRNA-491-5p 載體過表達 miRNA-491-5p 的 程 度 定量PCR 進行均一化處理，結果顯示非轉染 HEK293T 細胞組為 1，空載體 PCDH-511B 轉染 HEK293T 細胞組相對于非轉染 HEK293T 細胞組無顯著變化\\(1.19±0 . 14 \\) ，而 PCDH - 511B - miRNA - 491 - 5p 轉 染HEK293T 細胞組為\\(1 000.18±1.14\\)，差異具有統計學意義\\(P<0.01\\)。根據 2-ΔΔCt方法算出 miRNA-491-5p表達變化的倍比關系，結果表明 PCDH-511B-miR－NA-491-5p 轉染 HEK293T 細胞組的 miRNA-491-5p 表達明顯高于其他兩組，見圖 3。這表明：PCDH-511B-miRNA-491-5p 慢病毒過表達載體構建成功，可用于后續實驗。
2.3 PCDH-511B-miRNA-491-5p 病毒顆粒包裝PCDH-511B-miRNA-491-5p 重組質粒載體和空載體質粒與病毒包裝系統共同轉染 HEK293T 細胞，HEK293T 細胞部分融合，出現多核復合體；隨著病毒增殖，細胞逐漸從壁上脫落，出現細胞病變效應。
2.4 篩選 miRNA-491-5p 的穩定表達細胞株 PCDH-511B-miRNA-491-5p 慢病毒過表達載體及空載體PCDH-511B 病毒顆粒感染 AGS 細胞后 72 h 觀察到細胞熒光。進一步將感染過的細胞傳代，按實驗要求每天檢測細胞并觀察活細胞生長比例，以及 GFP 表達的水平及所占比例。兩周后，根據各組病毒感染效率篩選出 miRNA-491-5p 的穩定表達細胞株\\(圖 4\\)。
3、討論
MicroRNA 是一類在各種生物體內廣泛存在的非編碼的、單鏈的、不編碼蛋白質的小分子 RNA，長度為 20~24 個堿基。1993 年，在研究線蟲的過程中人們發現了第 1 個 microRNA 分子，自此之后，人們陸續在不同物種中發現了多種 microRNA 分子。
目前，在 miRBase 數據庫\\(第 19 版\\)中已包含 100 多個物種，共計 21 264 條 microRNA 序列。在人類中，目前已經發現了 1 600 種前體 microRNA\\(precursormicroRNA，pre-miRNA\\)和 2 042 種成熟的 microRNA。
編碼人 microRNA 的基因占到基因組的 1%左右，調控約 1/3 的基因。MicroRNA 可以通過兩種方式起到其生物學作用：第 1 種方式為 microRNA 與靶mRNA 完全結合，從而使其斷裂降解；第 2 種方式為microRNA 與靶 mRNA 部分配對，此時其與 mRNA的 3’UTR 部分結合從而抑制其翻譯，影響蛋白質表達的效率，但是并不影響 mRNA 的穩定性。通過與靶 mRNA 的結合，microRNA 參與多種調控過程，與人類的多種系統的疾病密切相關。MicroRNA 在腫瘤的發生過程中也起著十分重要的作用，可參與大多數腫瘤相關基因的表達過程。
慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1 來源的一種病毒載體，慢病毒載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載體系統的主要組成部分。攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細胞或活體組織，實現外源基因在細胞或活體組織中表達。
本研究構建了 miRNA-491-5p 過表達載體，轉染HEK293T細胞后發現PCDH-511B-miRNA-491-5p慢病毒過表達載體在 HEK293T 細胞中成功表達，表明 PCDH-511B-miRNA-491-5p 慢病毒過表達載體構建成功，可用于后續實驗。接著將其包裝成病毒顆粒，該病毒可以高效感染 AGS 細胞，通過加入含有適量濃度\\(由殺滅曲線確定\\)的 puromycin\\(嘌呤霉素\\)，通過篩選獲得 miRNA-491-5p 穩定表達細胞株。為進一步分析 miRNA-491-5p 對胃癌細胞的作用機制奠定基礎。
