纖維素是地球上分布最廣、蘊藏量最豐富的生 物質，也是最廉價的可再生資源。纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系總稱，它們協同作用，分解纖維素產生寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖，有效地減少了污染。隨著纖維素酶在工業上的廣泛應用，特別是在紡織工業和能源工業上的應用，它已成為最近十幾年酶工程研究的一個焦點。大腸桿菌\\(Escherichia coli\\)具有繁殖迅速、培養簡單、遺傳背景清楚、基因克隆表達系統成熟完善等優點，是人們表達重組酶的第一選擇。在大腸桿菌中表達外源基因受到的影響很多，比如表達載體的拷貝數和穩定性，翻譯起始效率以及重組蛋白的穩定性。而翻譯起始效率跟 mRNA5'起始端二級結構的穩定性以及稀有密碼子的使用頻率有著很大的關系。據報道，mRNA 翻譯起始區域中的 SD 序列與翻譯起始位點 ATG 之間的空間構象和翻譯效率有很大關系。通過對大腸桿菌的各種編碼基因分析，發現同義密碼子的相對使用頻率，即 RSCU\\(Relative synonymous codon usage\\) 的值不同。
熱 纖 梭 菌 \\( Clostridium thermocellum ATCC27405\\)是一種高溫厭氧細菌，它的纖維素酶和半纖維素酶構成多酶復合體，纖維素酶主要是由內切β-1，4-葡聚糖酶 \\( C1 酶\\)、外切 β-l，4-葡聚糖酶 \\( Cx酶\\)和葡萄糖苷酶 3 種酶組成的。其中，內切 β-l，4-葡聚糖酶是分解纖維素最主要的酶。嗜熱梭菌產生的纖維素酶耐熱性好，但由于熱纖梭菌是一種嚴格的厭氧菌，該菌的培養條件極其苛刻，其纖維素酶的分泌必須在高度厭氧的條件下進行，且菌株產酶量相對較低，不適合在工業中大規模發酵生產。而采用分子生物學手段，將嗜熱酶基因導入大腸桿菌中高效表達，是一種非常有效的方法。
本研究將重組質粒 pHsh-celD 經過兩步優化實現此纖維素酶在大腸桿菌 E． coli BL21-CodonPlus\\(DE3\\)-RIL 中高效表達，構建高酶活、耐熱和產酶條件要求低的纖維素酶基因工程菌，為該酶在工業上的開發及利用提供基礎資料。
1 材料與方法
1． 1 材料
大腸桿菌 E． coli DH10B，E． coli BL21-Codon-Plus\\(DE3\\)-RIL\\(購自 Promega 公司\\) 采用 Luria-Bertani\\(LB\\) 培養基:胰蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5g / L，NaCl 10 g / L。固體培養基添加終濃度為 2%的瓊脂粉。
質粒 pHsh-celD 由本實驗室構建并保存。該表達載體 pHsh 是由大腸桿菌 σ32因子調控，包括一個熱激啟動子和終止子，通過熱激誘導外源基因表達。
1． 2 方法
1． 2． 1 基因操作 熱纖梭菌基因組提取與 DNA 操作采用分子克隆技術標準方法進行。質粒轉化采用電轉化方法進行，質粒和 PCR 產物采用 Qiagen plas-mid kit 和 PCR purification kit\\(Qiagen USA\\)純化。
1． 2． 2 重組表達質粒 pHsh-celD mRNA 二級結構的優化 對重組表達質粒 pHsh-celD 的翻譯起始位點AUG 附近的 mRNA 二級結構的空間構象和 mRNA二級結構的自由能進行在線分析\\(form1-2． 3． cgi\\)，在不改變目的基因編碼區氨基酸以及啟動子序列的前提下，利用同義突變的方法，達到破壞 mRNA 的核糖體結合位點及翻譯起始位點的莖環結構，提高mRNA 自由能的目的，得到具有最佳 mRNA 二級結構及自由能的質粒 pHsh-celD I。所分析的序列選擇為從轉錄起始位點 ACC 開始至下游 70 個堿基，由于所使用的載體是溫控型載體，外源基因表達的溫度是 42 ℃，因此在軟件設置中將 mRNA 形成的溫度由默認的 37 ℃改成 42 ℃，其他設置為默認。
pHsh-celD 分析序列: 5'-ACCTGTTAACCGTCGA-CAAGAAGGAGATATACCCATGGAGGAGACCAAAGTGTCAGCTGCAAAAATAACG-3';pHsh-celD I 分析序列:5'-ACTTATTAATATTAGAAAAGAAGGAGATATACAAATG-GAGGAGACCAAAGTGTCAGCTGCAAAAATAACG-3'。以重組質粒 pHsh-celD 為模板，設計引物 P1 和 P2 進行定點突變，引物序列如下\\(加粗部分為突變位點\\)。P1:5'-AAGAAGGAGATATACAAATGGAGGAGACCAAAGTGT-C-3'; P2: 5'-TTCTAATATTAATAAGTCATTGGATCAT-GGGGATGTTTC -3';按 PrimeSTAR HS DNA polymerase常規PCR 方法擴增，反向PCR 反應體系為550μl，PCR反應條件: 98 ℃變性25 s;60 ℃退火30 s，72 ℃ 4 min30 s，循環20 次;72 ℃ 10 min。PCR 產物電泳檢測正確后割膠回收 DNA 片段，經磷酸化后自身環化，將優化后表達質粒命名為 pHsh-celD I，并轉化至 E． coliDH10B，挑取陽性克隆，提取質粒酶切驗證。雙酶切驗證正確的質粒送上海美吉生物技術公司測序。
1． 2． 3 重組表達質粒 pHsh-celD I N 端密碼子的優化對重組表達質粒 pHsh-celD I 的全部堿基在線密碼子使用頻率軟件分析\\(http:/ /gcua． schoedl． de/\\)，在不改變目的基因編碼區氨基酸的前提下，利用同義突變的方法，將 N 端的11 ～29 位氨基酸的密碼子進行突變，將其突變成大腸桿菌的最優密碼子。pHsh-celD I N 端堿基分析序列:5'-ATAACG-GAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTTATA-3'; 將 celD 的 N 端第 11 ～ 29位 氨 基 酸 的 密 碼 子 進 行 突 變。以 重 組 質 粒pHsh-celD I為模板，設計引物 P3 和 P4 進行定點突變，優化表達質粒的 N 端密碼子。引物序列如下\\(加粗部分為突變位點\\)。P3:5'-CGTATCCGTCTGAACTCTATCGGTTTCATCCCGAACCACAGCAAAAAGGCGACT-3';P4:5'-AGAGTCGAACTGGTAGTTTTCGGTGATTTTTGCAGCTGACACTTTGGTCTC -3'。
按 PrimeSTAR HS DNA polymerase 常規 PCR 方法擴增，反向 PCR 反應體系為 50 μl，PCR 反應條件: 98℃ 變性 25 s;60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 4 min 30 s，循環20 次;72 ℃ 10 min。PCR 產物電泳檢測正確后割膠回收 DNA 片段，經磷酸化后自身環化，并轉化至E． coli DH10B，挑取陽性克隆，提取質粒酶切驗證。雙酶切驗證正確的質粒送上海美吉生物技術公司測序。
1． 2． 4 重組蛋白的表達與純化 重組質粒 pHsh-celD，pHsh-celD I，pHsh-celD II 電轉化到宿主細胞E． coli BL21-CodonPlus\\(DE3\\)-RIL 中，挑取重組單菌落接種于含 100 μg/ml 的氨芐青霉素的 LB 培養液中，30 ℃振蕩培養至 OD600達到 0． 6 ～0. 8 時 轉入42 ℃ 水浴搖床進行熱激表達，繼續培養 8 h 后離心收集菌體。用 50 mmol/L pH 7． 5 的 Tris-HCl 緩沖液洗滌細胞 2 次，并用相同緩沖液重懸細胞，置于冰水浴中用超聲波儀破碎后，將細胞碎片于 12 000r / min 離心 10 min，去除上清液即為粗酶液。粗酶液在 60 ℃熱處理 30 min 后，4 ℃、12 000 r/min 離心 30 min 去除變性蛋白。
1． 2． 5 纖維素酶酶活測定 羧甲基纖維素鈉\\(CMC\\) 活性及纖維素酶活性測定方法參考文獻［15］進行。纖維素酶活性單位定義為每分鐘催化產生 1 μmol 還原糖的酶量。
2 結果與分析
2． 1 重組表達質粒 pHsh-celD 二級結構的優化
由圖 1Ⅰ可知，重組載體 pHsh-celD 的 mRNA 二級結構在 SD 序列處形成了一個發卡結構，阻礙核糖體和 mRNA 區域的結合，從而影響了翻譯起始的效率。分析區域的自由能是 －5. 22 cal/mol，可能形成穩定的二級結構，不利于基因的高效表達。在不改變目的基因翻譯的氨基酸序列的前提下，盡可能使用同義密碼子和改變無關堿基的方法嘗試突變一些位點，設計了突變引物。以 pHsh-celD為模板，PCR 擴增出優化后的序列，再經過磷酸化連接得到新的重組載體 pHsh-celD I。將 pHsh-celD I的翻譯起始區域的序列進行在線分析，得到其形成的 mRNA 空間構象，如圖 1Ⅱ。由圖可知，優化后重組載體的 mRNA 二級結構中，原來的發卡結構被徹底破壞，SD 序列和 AUG 均被釋放到一個很大的環狀結構中，核糖體能夠毫無阻礙地與 mRNA 結合，開始重組蛋白的翻譯。所分析區域的自由能也變為－ 4. 8 cal / mol，由于自由能的絕對值越小，所形成的mRNA 結構越不穩定，從而更利于翻譯的順利進行?！緢D.略】
2． 2 重組表達質粒 pHsh-celDⅠN 端密碼子的優化
通過對大腸桿菌的各種編碼基因分析，發現同義密碼子的相對使用頻率，即 RSCU 的值不同。大腸桿菌密碼子的 RSCU≥1 為優勢密碼子，0． 05 ＜RSCU ＜ 1 即非優勢密碼子，RSCU≤0. 05 為稀有密碼子。當翻譯遇到稀有密碼子時需要經過多次辨認才能找到正確的 tRNA，因此外源蛋白的合成就會在此處停頓，在含有較多的稀有密碼子，或者相同的稀有密碼子連續出現時，會發生明顯停頓，抑制蛋白合成，有時甚至會發生密碼子的錯配。其中 AGA、AGG、CGA、CGG 編碼的精氨酸\\( Arg\\)、AUA 編碼的異亮氨酸\\(Ile\\)和 CCC 編碼的脯氨酸\\(Pro\\)是極端稀有密碼子，對外源基因的表達抑制作用更大。
對重組表達質粒 pHsh-celD I 全部編碼框基因的密碼子使用頻率進行在線分析 \\(http:/ /gcua．schoedl． de / \\) ，celD I 的 N 端從第 11 位氨基酸就遇到了異亮氨酸\\(Ile\\)的極端稀有密碼子 AUA，第 20位氨基酸遇到了精氨酸\\(Arg\\) 的極端稀有密碼子CGA，這 2 個極端稀有密碼子對外源基因的表達存在抑制作用。同時從第 11 位氨基酸到第 29 位氨基酸其他的密碼子也非優勢密碼子。原始序列為:5'-ATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTTATA-3' \\( 圖 2a \\)。 在不改變目的基因翻譯的氨基酸序列的前提下，盡可能地改用大腸桿菌的同義密碼子，嘗試突變一些位點，突變 后 序 列 為: 5'-ATCACCGAAAACTACCAGT-TCGACTCTCGTATCCGTCTGAACTCTATCGGTTTCATC-3'\\(圖 2b\\)，突變為大腸桿菌的優勢密碼子。由于這一段區域比較集中，所以一次性設計突變引物，以pHsh-celD I 為模板，PCR 擴增出優化后的序列，再經過磷酸化連接得到新的重組載體 pHsh-celD II?！緢D.略】
2． 3 重組纖維素酶的表達及檢測
為檢測優化 mRNA 二級結構和優化 N 端密碼子 的 效 果，分 別 以 pHsh-celD、pHsh-celD I 和pHsh-celD II 轉化大腸桿菌 E． coli BL21 -Codon-Plus\\(DE3\\)-RIL，熱激誘導 6 h 后收集菌體。以pHsh 轉化產物為對照，SDS-PAGE 分析結果 \\( 圖3\\) 表明，重組菌均能產生約分子量為66 000 的特異條帶，與預期的蛋白相對分子量大小一致;含質粒 pHsh-celD 的重組菌中蛋白表達量較低，含質粒 pHsh-celD I 的重組菌中蛋白表達量提高，含質粒 pHsh-celD II 的重組菌中蛋白表達量顯著提高。這說明對重組質粒 mRNA 二級結構及 N 端密碼子的優化取得了預期的效果，目的蛋白的表達量得到很大提高。
2． 4 重組纖維素酶的酶活檢測
含 pHsh-celD、pHsh-celD I、pHsh-celD II 的大腸桿菌菌液最高酶活分別達到 \\(4．1 ± 0.3\\) U/ml、\\(5． 8 ± 0. 3\\)U / ml、\\(6． 4 ± 0. 4\\)U / ml。重組菌 pHsh-celD II 的酶活是最初的重組菌 pHsh-celD 的 1. 6 倍。這與 SDS-PAGE 檢測到的蛋白表達結果完全一致。
3 討 論
為了在大腸桿菌細胞中合成某種特殊的外源酶，以滿足工業化的要求，僅僅停留在檢測水平的表達是遠遠不夠的，必須設法提高表達量。就目前所知，有許多因素如啟動子的強度、DNA 轉錄起始序列、密碼子的偏好性、mRNA 二級結構、信號肽的結構、質粒的拷貝數以及質粒的穩定性和宿主細胞的生理特征等，都會不同程度地影響到克隆基因的表達效率。本研究主要討論外源基因本身的特征以及由此決定的表達水平，即密碼子使用頻率、mRNA 可能形成的二級結構的問題。
影響外源基因表達的重要因素之一是翻譯起始效率。在本研究中，分析區域的自由能是 － 5. 22cal / mol，可能形成穩定的二級結構，不利于基因的高效表達，由此我們進行了第一次優化。優化后分析區域的自由能變為 － 4. 8 cal/mol，由于自由能的絕對值越小，所形成的 mRNA 的結構越不穩定，從而更利于翻譯的順利進行。
本研究將重組質粒 pHsh-celD 的 mRNA 二級結構和 N 端密碼子進行了兩步優化最終實現了該酶的高效表達。我們所采用的熱激載體 pHsh 作為表達載體是由大腸桿菌σ32因子調控，包括一個熱激啟動子和終止子，通過熱激就可以高效地表達外源基因，所以在誘導外源基因表達過程中就不需要加入化學誘導劑。而化學誘導劑如 IPTG 比較昂貴，是基因工程菌株在工業化應用中的一個瓶頸，而熱激誘導能很好地減少基因誘導表達時的成本，這無疑在工業化應用中具有巨大的優越性和現實意義。
參考文獻:
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