物種復合體（species complex）是指通過雜交和多倍化產生的親緣關系復雜、遺傳分化很小的多類群復雜物種系統（Koch et al.，2003；Lo et al.，2010；Durkovic et al.，2012）。變葉海棠物種復合體（Malus toringoides species complex）是蘋果屬野生資源中變異式樣和種間關系很復雜的一個復合體，由變葉海棠、花葉海棠、隴東海棠、多毛海棠、馬爾康海棠和小金海棠 6 個物種組成（成明昊 等，2000，2002，2003；石勝友 等，2004）。AFLP 標記分析和多拷貝核基因 ITS 序列變異支持變葉海棠是花葉海棠和隴東海棠雜交后代的觀點（石勝友 等，2005；Feng et al.，2007）；通過詳細的野生資源調查研究，另外 3 個與變葉海棠近緣的類群被界定為物種并歸入變葉海棠物種復合體。

其中馬爾康海棠的花、葉和果實等分類學性狀介于變葉海棠和隴東海棠之間，而多毛海棠的性狀則介于變葉海棠和花葉海棠之間（成明昊 等，2002，2003；鄧洪平 等，2002）。小金海棠的葉片和花部性狀與隴東海棠近似，而核型與四倍體變葉海棠相似（梁國魯和李曉林，1993；成明昊 等，2000）。

在地理分布上，變葉海棠物種復合體目前界定的 6 個物種在四川西部山區呈同域分布（成明昊 等，1999）。上述證據顯示這些物種彼此具有非常緊密的親緣關系。

前人的研究不僅豐富了對野生蘋果資源的認識，也在一定程度上揭示了變葉海棠物種復合體中物種的遺傳來源（鄧洪平 等，2002；石勝友 等，2004）。與多拷貝核基因（如 ITS 序列）相比，單拷貝核基因用于野生果樹資源的研究具有如下優勢。首先，避免了致同進化（concerted evolution）導致的序列均一化，雜種中兩個親本所特有的核苷酸變異可以完整保留下來，有助于雜種的識別和雜交親本的確定（Sang，2002）。其次，單拷貝核基因基本不受基因重復的影響，能夠很好地反映物種真實的進化關系（Zou et al.，2008）。單拷貝核基因已經成功應用在作物資源遺傳關系的研究上（Geet al.，1999；Doyle et al.，2004；Brassac et al.，2012）。使用編碼淀粉分支酶的單拷貝核基因 SbeⅠ探究變葉海棠物種復合體中 6 個物種的遺傳關系。SbeⅠ基因分析進一步證實變葉海棠源于雜交，花葉海棠是雜交親本之一，但是排除隴東海棠參與了變葉海棠的雜種起源。同時 SbeⅠ分析顯示多毛海棠與變葉海棠，以及馬爾康海棠與小金海棠具有相同的遺傳組成，并且后兩者是變葉海棠與隴東海棠進一步雜交產生的后代（Tang et al.，2014）。

物種分類界定不僅是分類學和進化生物學研究的重要問題（De Queiroz，2007；Fujita et al.，2012），也是野生資源鑒定、評價、利用和保護研究中需要首先解決的基本問題。變葉海棠物種復合體中的類群能否界定為 6 個獨立的物種？如果不能全部界定為物種，哪些需要歸并？至今沒有得到解決。本研究在闡明變葉海棠物種復合體類群遺傳來源的基礎上，通過單拷貝核基因 SbeⅠ探究其物種界定和居群遺傳分化模式，確定復合體類群的分子分化水平，并闡明類群的分類學地位，以期為蘋果屬野生資源的鑒定、利用和保護提供指導和科學依據。

1、 材料與方法

1.1 變葉海棠物種復合體物種取樣

2011 年 6 月在四川省阿壩藏族羌族自治州的阿壩縣、馬爾康縣和小金縣采集變葉海棠物種復合體居群樣品（表 1）。一共采集了不同地點的 10 個自然居群的葉片材料，每個居群隨機挑選 2 ~ 6 個個體，不同個體間隔 30 m 以上，葉片材料經硅膠干燥后帶回西南大學，保存在–20 ℃冰箱中備用。

變葉海棠物種復合體除花葉海棠和隴東海棠外，其余均為無融合生殖類群，同一類群僅由一種基因型構成（Tang et al.，2014），因此現有居群取樣基本能代表整個變葉海棠物種復合體。

1.2 PCR 擴增、克隆和測序

采用 CTAB 法（Doyle & Doyle，1987）提取葉片總 DNA，稀釋至合適濃度。SbeⅠ基因的引物根據栽培蘋果的 SbeⅠ基因外顯子序列設計，上、下游引物分別為 M1014F（5′ ATAGTGAGCAGCACAAATG 3′）和 M1014R（5′ TGCCTCCTCACTTTCAT 3′）。PCR 反應體系為 25 ?L，包括 2.5 ?L 10×Ex Taq 緩沖液，10 ~ 50 ng 的基因組 DNA，2.0 mmol ? L-1的 MgCl2，0.2 mmol ? L-1的每種 dNTP，0.1?mol ? L-1的上下游引物，1.0 U 的 Ex Taq 酶。擴增程序：94 ℃預變性 1 min，然后 94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 個循環，最后 72 ℃延伸 10 min。擴增產物在 1.5%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，純化回收之后克隆至質粒載體，轉化 TOP10 大腸桿菌。每個樣品挑選 8 ~ 16個陽性克隆，提取質粒后送英駿公司（重慶）的 ABI3730 測序儀測序。

1.3 物種界定分析

SbeⅠ核苷酸序列的多序列比對由 ClustalX 軟件（Thompson et al.，1997）在默認參數設置下進行，然后手工調整同源性排列不恰當的部分。PCR 擴增過程中產生的重組序列由 RDP3 軟件（Martinet al.，2010）識別并去除。挑選代表性 SbeⅠ序列用于后續數據分析。根據 Modeltest 3.7 的 AIC 優化標準（Posada & Crandall，1998）確定 SbeⅠ最優核苷酸替換模型，然后使用 PHYML 軟件（Guindonet al.，2010）構建 SbeⅠ最大似然進化樹，進化樹拓撲結構的可靠性通過 100 次自展（bootstrap）檢驗進行評價。我們使用 GSI 指數 genealogical sorting inde（xCummings et al.，2008）和 PTP 模型 Poissontree processes（Zhang et al.，2013）在兩個進化等級上進行物種界定分析。一是將 SbeⅠ的整個最大似然進化樹用于物種界定，同時也對進化樹的 3 個進化枝逐一進行物種界定分析。為了考慮拓撲結構估計中存在的不確定性，利用 100 次自展檢驗得到的進化樹構建主要規則一致樹，將其用于物種界定分析。所有的界定分析均通過在線分析工具（GSI 指數）和PTP 模型）完成。

1.4 居群遺傳學分析

對于 3 個進化枝以及進化枝的每個類群，使用 DNASP 程序（Librado & Rozas，2009）計算 SbeⅠ基因的核苷酸多樣性，指標包括分離位點個數、單倍型個數及其多樣性、核苷酸多樣性（π 和 θ 兩種度量指標）。變葉海棠物種復合體分類群間的成對固定指數 Fst也通過 DNASP 程序計算。采用MEGA5.10 程序（Tamura et al.，2011）計算不同類群的成對遺傳距離，同時也計算同一類群內部的遺傳距離。另外，計算任意兩條序列之間的遺傳距離。遺傳距離根據 MEGA5.10 程序的 Kimura 雙參數模型（Kimura，1980）進行度量。

2、 結果與分析

2.1 序列特征

共獲得了變葉海棠物種復合體的代表性 SbeⅠ基因序列 82 條，通過多序列比對，經手工調整后長 983 bp，包含 SbeⅠ外顯子 11 ~ 17 之間的核苷酸序列。SbeⅠ序列包含變異位點 26 個，其中簡約信息位點 22 個，絕大部分變異位點分布在內含子區域。

2.2 變葉海棠物種復合體物種界定結果

Modeltest3.7 確定最適合變葉海棠物種復合體 SbeⅠ基因的核苷酸替換模型為 HKY + I?；贖KY + I 模型使用 PHYML 構建了 SbeⅠ基因的最大似然進化樹，結果如圖 1 所示。

變葉海棠物種復合體的 SbeⅠ被分為 3 個大的進化枝（Clade 1 ~ 3），每個進化枝作為單系得到了很好的支持，但是進化枝內部的分歧關系基本沒有自展支持。進化枝 1 包含變葉海棠、多毛海棠、馬爾康海棠和小金海棠 4 個分類群；進化枝 2 由進化枝 1 的 4 個分類群再加花葉海棠構成；進化枝3 由隴東海棠、馬爾康海棠和小金海棠組成（表 1）。SbeⅠ基因最大似然分析結果與變葉海棠物種復合體遺傳來源研究結果 Tang 等（2014）的一致。

使用 SbeⅠ基因的整個拓撲結構進行物種界定分析，GSI 指數分析顯示每個進化枝的 GSI 指數接近或者等于 1，表明這 3 個進化枝可以清晰地界定為物種，并且 P 值在 0.01 水平上顯著（表 2）。PTP模型分析的結果和 GSI 指數的相同。

為了進一步探討組成進化枝的不同類群是否可以界定為獨立的物種，對每個進化枝逐一進行了GSI 指數和 PTP 模型分析。GSI 指數分析的結果見表 2，組成進化枝 1 的 4 個類群的 GSI 指數均為0，對應的 P 值全為 1，顯示進化枝 1 的 4 個類群不能被界定為物種。組成進化枝 2 的 5 個類群中，僅花葉海棠 GSI 指數的 P 值在 0.01 的水平顯著，其他 4 個類群 GSI 指數的 P 值均不顯著，表明這 4個類群在進化枝 2 上仍然不能界定為物種。進化枝 3 的 GSI 指數分析顯示其所包含的 3 個類群也都不能被界定為物種。雖然隴東海棠 GSI 指數的 P 值不顯著，但是 GSI 指數值相對較大，表明隴東海棠 SbeⅠ基因譜系匯聚的程度比馬爾康海棠和小金海棠的高。PTP 模型分析與 GSI 指數的物種界定結果基本一致，進化枝中的每個類群作為物種均未得到支持。

2.3 變葉海棠物種復合體的遺傳多樣性和遺傳分化

Tajima’s D 檢驗表明 SbeⅠ基因在變葉海棠物種復合體分歧過程中沒有偏離中性進化模式（表3）。由于進化枝之間的遺傳分化較大，因此以進化枝以及進化枝包含的分類群為單位計算遺傳多樣性，結果見表 3。以進化枝為單位，遺傳多樣性由低到高的順序是：進化枝 1 < 進化枝 3 < 進化枝2。以分類群為單位，多毛海棠的遺傳多樣性（π）大約是變葉海棠的 2.5 倍。馬爾康海棠和小金海棠的遺傳多樣性與其所處的進化枝有關。進化枝 1 中兩者均無變異，進化枝 2 中馬爾康海棠的多樣性高于小金海棠，而進化枝 3 中則是小金海棠的多樣性高于馬爾康海棠。

采用遺傳距離和固定指數 Fst兩個指標度量類群間的遺傳分化，結果見表 4。不同進化枝類群間的成對遺傳距離基本上都大于0.01，而同一進化枝的不同類群的成對遺傳距離大多在0 ~ 0.001之間，僅進化枝 2 的類群彼此的遺傳距離在 0.002 ~ 0.004 之間。進一步計算任意兩條 SbeⅠ基因序列的成對遺傳距離，并繪制遺傳距離的分布圖，結果見圖 2。就同一進化枝而言，類群內的遺傳距離和類群間的遺傳距離在分布范圍上重疊，而位于不同進化枝的類群其成對遺傳距離主要分布在 0.009 ~0.016 之間，幾乎不與前兩者的遺傳距離分布重疊。成對遺傳距離的分布模式顯示，進化枝中不同類群彼此間的遺傳分化水平與同一類群不同個體間的遺傳分化水平相當。