全世界約有薔薇屬（Rosa L.）植物 200 多個種和變種，廣泛分布于亞、歐、北非、北美等寒溫帶至亞熱帶地區。中國分布有 95 種薔薇，分為 2 個亞屬 10 個組（Ku & Robertson，2003），是重要的月季種質資源。進行準確的核型分析是將其有效應用于月季遺傳改良的前提。由于薔薇屬植物染色體較小，缺乏明顯可見具有隨體的染色體（李懋學和張贊平，1996；Crane & Byrne，2003；蹇洪英 等，2009），傳統的核型分析難以做到準確的同源配對。以核糖體 RNA 基因（rDNA）為探針的染色體熒光原位雜交是對染色體較小且形態相近的物種進行染色體分析的有效手段（Liu & Wendel，2003；徐延浩 等，2007）。rDNA-FISH 應用于薔薇屬植物的研究已有一些報道（Ma et al.，1997；Fernàndez-Romero et al.，2001；Akasaka et al.，2002，2003；Lim et al.，2005；田敏 等，2012，2013a，2013b；Jian et al.，2013b）。田敏等（2012，2013a，2013b）和 Jian 等（2013b），采用熒光原位雜交技術檢測了 45S rDNA 在部分野生種、古老月季品種及現代月季品種中數量和信號強弱的差異，但中國應用熒光原位雜交技術對薔薇屬植物進行研究尚屬起步階段。

多苞薔薇種內具有豐富的表型變異（中國農業科學院中國植物志編輯委員會，1985），川滇薔薇耐旱和耐貧瘠（周志瓊 等，2009），金櫻子具有較好的抗蟲性（魏開炬 等，2013），目前尚未見rDNA 在多苞薔薇和川滇薔薇染色體上定位的研究；Ma 等（1997）僅報道了金櫻子的染色體組有 1對 45S rDNA 位點，并未進行核型分析。本研究中利用雙色熒光原位雜交技術對 45S 和 5S rDNA 在多苞薔薇、川滇薔薇和金櫻子的體細胞染色體上進行定位，為這 3 種薔薇屬植物的染色體識別提供明確有效的標記，為進一步利用這 3 種薔薇對現代月季進行遺傳改良提供分子細胞遺傳學背景資料。

1、 材料與方法

1.1 材料

材料分別為桂味組（Section Cinnamomeae）的多苞薔薇（Rosa multibracteata Helm. et Wils.）、合柱組（Section Synstylae）的川滇薔薇（R. soulieana Crép.）及金櫻子組（Section Laevigatae）的金櫻子（R. laevigata Michx.），均保存于云南省農業科學院花卉研究所的月季種質資源圃中。本試驗于2012 年 8 月采集嫩芽預處理后進行染色體制片，原位雜交試驗于 2013 年 1 月完成。

1.2 探針標記

45S rDNA 克隆自番茄，質粒由武漢大學生命科學學院李立家教授提供，用 EasyPure PlasmidMiniPrep Kit 提?。ū本┤浇鹕锛夹g有限公司），以生物素（Biotin-16-dUTP）用缺口平移法標記（Roche，Biotin-Nick Translation Mix，No.11745824910）；5S rDNA 以 PCR 方法獲得，參照 Akasaka等（2002）的方法制備，并以 PCR 產物純化試劑盒純化（上海杰瑞生物工程有限公司），以地高辛（Dig-11-dUTP）用缺口平移法標記（Roche，Dig-Nick Translation Mix，No. 11745816910），按說明書的方法操作。

1.3 染色體制片、原位雜交、圖像檢測及分析

染色體制片參照 Ma 等（1997）的方法。原位雜交流程參照 Akasaka 等（2003）的方法進行。

雜交圖像在 Zeiss 熒光顯微鏡（Axiophot 2）下觀察并獲取，用 Zeiss 系統軟件及 Photoshop 軟件對圖像進行處理分析。核型分析采用李懋學和陳瑞陽（1985）的標準，核型類型根據 Stebbin（1971）的分類標準劃分，染色體排序參考 Jian 等（2013a）的常規核型分析的結果排列。

2、 結果與分析

2.1 多苞薔薇 45S rDNA 和 5S rDNA 的雙色熒光原位雜交

以 45S rDNA 和 5S rDNA 為探針的 3 種薔薇屬植物的熒光原位雜交結果及核型見圖 1 和表 1。

45S rDNA 和 5S rDNA 在多苞薔薇上（圖 1，A、A’）各檢出 1 對位點。本試驗中發現多苞薔薇有兩種核型，一種（圖 1，A）核型公式為 2n = 2x = 14 = 12m + 2sm，核型為 1A 型，除 4 號染色體為亞中部著絲點染色體（sm）外其它都是中部著絲點染色體（m），此類型中 45S rDNA 定位在 4號染色體的短臂上（S），1 個雜交信號比另 1 個稍弱；5S rDNA 位于 5 號染色體長臂（L）的近著絲點端，1 個雜交信號比另 1 個稍弱。另一種類型（圖 1，A’）核型公式為 2n = 2x = 14 = 10m + 4sm，核型為 2A 型，除 3 號和 6 號為亞中部著絲點染色體（sm）外，其余均為中部著絲點染色體（m），而且 3 號和 6 號都是異形同源染色體，此類型中 45S rDNA 定位在 3 號染色體的短臂上（S），雜交信號較長染色體的稍弱；5S rDNA 位于 6 號（sm）染色體的長臂（L）的近著絲點處，雜交信號較長染色體的稍弱一些。

2.2 川滇薔薇 45S rDNA 和 5S rDNA 的雙色熒光原位雜交

45S rDNA 和 5S rDNA 在川滇薔薇上（圖 1，B）分別檢出 1 對和 2 對位點?；?rDNA-FISH的川滇薔薇核型公式為 2n = 2x = 14 = 10m + 4sm，核型為 2A 型，4 號和 7 號染色體為亞中部著絲點染色體（sm），其余為中部著絲點染色體（m），其中 7 號為異形同源染色體。45S rDNA 位于 7 號染色體的短臂上（S），較短染色體的信號稍弱一些。5S rDNA，1 對位于 4 號染色體長臂（L）的近著絲點端，1 個雜交信號較另 1 個強很多；另 1 對位于 7 號染色體長臂（L）的近著絲點端，較短染色體的信號稍弱一些，其信號強度介于 4 號染色體兩個信號的強度之間。

2.3 金櫻子 45S rDNA 和 5S rDNA 的雙色熒光原位雜交

45S rDNA 在金櫻子上（圖 1，C）檢出 1 對位點。5S rDNA 檢出 2 對位點?；?rDNA-FISH的金櫻子核型公式為 2n = 2x = 14 = 10m + 4sm，核型為 2A 型，4 號和 5 號為亞中部著絲點染色體（sm），其余為中部著絲點染色體（m），其中 4 號為異形同源染色體。45S rDNA 位于 4 號染色體的短臂上（S），雜交信號強弱一致；5S rDNA 1 對位于 4 號染色體的長臂（L）的近著絲點處，另 1對位于 6 號染色體長臂（L）的近著絲點處，位于 4 號染色體的 1 對雜交信號比 6 號染色體的弱。

3、 討論

本研究中基于 rDNA-FISH 的核型分析發現多苞薔薇有兩種核型類型，一種與 Jian 等（2013a）基于常規核型分析的結果相同，屬較為原始的 1A 型，另一種為更進化的 2A 型（Stebbins，1971）。

前者沒有異形同源染色體，且 5S rDNA 位點染色體不是 sm 染色體；后者的兩對 rDNA 染色體都是異形同源染色體。本課題組保存的多苞薔薇來自 3 個居群，本研究中發現其具有兩種核型，可能是由于兩種核型的多苞薔薇來自不同居群，它們之間存在核型差異，需要對不同居群的多苞薔薇分別取樣研究。這也從細胞水平上反映了為何多苞薔薇種內形態變異豐富（中國科學院中國植物志編輯委員會，1985）。唐開學（2009）認為川滇薔薇種內存在著豐富的居群間和居群內表型變異。本研究中川滇薔薇核型及核型公式與 Jian 等（2013a）基于常規核型分析的結果相同，但兩對 sm 染色體的序號相差較大，這可能是由于研究材料來源不同所致。金櫻子在核型和核型公式上與 Crane 和 Byrne（2003）及 Jian 等（2012）基于常規核型分析的結果相同，但在染色體排序上稍有差別。因此，薔薇屬植物不僅在種間存在豐富的核型多樣性（唐開學，2009；Jian et al.，2013a），種內也存在豐富的變異，應采用熒光原位雜交等較精確的方法對一些分布較廣、種內存在豐富形態變異的薔薇進行進一步的核型研究。本研究中還發現這 3 種薔薇屬野生種均存在異形同源染色體，它們分別是多苞薔薇（圖 1，A’）3 號和 6 號染色體、川滇薔薇 7 號染色體和金櫻子 4 號染色體，異形同源染色體在相對長度上存在明顯差異，由于較大的長度差異使研究人員在通過常規染色體核型分析時很容易將其錯配?？梢娀?rDNA-FISH 的薔薇屬植物染色體核型分析更加準確可靠。

核糖體 RNA 基因（ribosomal DNA，rDNA）是具有重要功能的保守重復序列，成簇分布于 1對或多對染色體上（Pedersen & Linde-Laursen，1994）。45S rDNA 被認為在進化過程中相當保守，與核仁形成有關，一般在染色體的次縊痕部位，也可存在于非次縊痕位點（徐川梅 等，2007；軒淑欣 等，2007；徐晶，2009），李懋學和張贊平（1996）也指出，次縊痕既 NOR，但 NOR 不一定在次縊痕區。薔薇屬植物的染色體很小，在常規染色體分析中看不到次縊痕，無法識別核仁組織區，也很難識別其同源染色體。Akasaka 等（2002，2003）研究 rDNA 在薔薇屬 9 個二倍體野生種的分布中發現 45S rDNA 均定位在 1 對異形同源 sm 染色體短臂的近端部。本研究中多苞薔薇、川滇薔薇和金櫻子都只有 1 對 45S rDNA 位點，大都位于 1 對異形同源 sm 染色體的短臂上。一般認為，隨體是高度惰性的異染色質，著絲點附近區域亦是異染色質集中分布的區域。對其他物種的研究表明，45S rDNA 位點可能位于長臂或短臂上，但基本分布于近著絲點處（軒淑欣 等，2007）。Fransz 等（2002）認為，在間期核中常染色質與異染色質都是具有特定空間結構的，從而順利實現基因的表達調控。那么薔薇屬植物中 45S rDNA 位點分布于 1 對異形同源 sm 染色體的短臂上應當與其特定功能有關。目前已有的報道（Ma et al.，1997；Fernàndez-Romero et al.，2001；Akasaka et al.，2002，2003；Lim et al.，2005；田敏 等，2012，2013a，2013b；Jian et al.，2013b）表明有 20 個薔薇屬二倍體野生種的 45S rDNA 位點數與其染色體倍性相同，即 1 個染色體組有 1 個 45S rDNA 位點，但卡羅萊納組（Sect. Carolinae）的 R. foliolosa（2n = 2x = 14）有 6 個 45S rDNA 位點，分別位于 3 對sm 染色體短臂的端部，可見在薔薇屬二倍體野生種中的 45S rDNA 數存在明顯差異。需要積累更多野生薔薇 rDNA 的研究資料以便探討它們的系統關系。

5S rRNA 是核糖體大亞基的組成成分之一，每個 5S rDNA 單元包括 120 bp 左右的轉錄區和 100 ~700 bp 的非轉錄區（Appels & Baum，1992）。Mantovani 等（2005）發現在大部分已進行了 5S rDNA定位的物種中，其數量以 1 對或 2 對為主，但在染色體上沒有固定的分布模式。Akasaka 等（2002；2003）在研究中發現，薔薇屬 9 個二倍體野生種中 5S rDNA 位點數有 2 個（1 對）、3 個和 4 個（2對），其中只有 1 對的種的 5S rDNA 位點位于非 45S rDNA 染色體長臂的近著絲點處；有 3 個或 2對的種其 5S rDNA 有 1 對與 45S rDNA 位于同一染色體的長臂或短臂上，其余位點位于另外染色體的長臂的近著絲點處。Lim 等（2005）的研究表明 5S rDNA 在五倍體狗薔薇中有 8 個位點均位于染色體長臂的近著絲點處，其中有 3 個位點與 45S rDNA 位于同一染色體，另外 5 個位點位于另外的染色體上。本研究中多苞薔薇有 1 對 5S rDNA 位于非 45S rDNA 染色體的長臂的近著絲點處，川滇薔薇和金櫻子有 2 對 5S rDNA 位點，其中 1 對位于 45S rDNA 染色體的長臂的近著絲點處，另 1 對位于其它染色體長臂的近著絲點處?？梢?，薔薇屬植物中 5S rDNA 位點按是否與 45S rDNA 有共線性分為兩種：只有 1 對 5S rDNA 位點的與 45S rDNA 沒有共線性，且位于 1 對染色體長臂的近著絲點處；有 3 個或 2 對 5S rDNA 位點的，與 45S rDNA 有共線性的 5S rDNA 位點可位于染色體短臂或長臂的近著絲點處，另外的位點位于其它染色體長臂的近著絲點處。

本研究中通過雙色熒光原位雜交技術對多苞薔薇、川滇薔薇和金櫻子 3 種薔薇野生種的 45S 與5S rDNA 在體細胞中期染色體上進行物理定位，不但能準確地識別各自染色體組中的同源染色體，而且還能通過雜交位點數量、位置和強弱體現各自染色體的結構特征，為這 3 種植物的染色體識別提供了明確有效的標記。rDNA 在薔薇屬植物上的應用已從分子細胞遺傳學層面對部分野生種、古老月季及現代月季間的關系作了一些闡述（Ma et al.，1997；Fernàndez-Romero et al.，2001；Akasakaet al.，2002，2003；Lim et al.，2005；田敏 等，2012，2013a，2013b；Jian et al.，2013b），為了更好地將薔薇野生資源應用于現代月季遺傳改良工作中，需要積累更多種薔薇的 rDNA-FISH 資料。已有的研究也表明以 rDNA 為探針還不能完全區分薔薇屬植物的每對同源染色體，應從薔薇屬植物的基因組中分離出其它特異重復序列作為探針以區分各對同源染色體，這不僅可用于探討薔薇屬植物的演化，還可在現代月季遺傳育種工作中明確染色體的去向，從而提高育種效率。