耐冬山茶\\(Camellia japonica\\)系指分布于青島地區的山茶野生種群或栽培群體,為山茶科山茶屬常綠小喬木或灌木,作為第三紀殘遺植物,此群體具有豐富的遺傳變異性.耐冬山茶可耐-10℃以下低溫,是我國北方地區珍稀的室外冬春兩季開花常綠植物,觀賞價值極高[1].目前耐冬山茶僅分布于山東青島及附近島嶼,野生植株只有幾千株,栽培植株數量也不甚多[2].對于這個古老、珍貴的觀賞種群,在園林中應用越來越廣泛,因此,擴大耐冬山茶的種質資源數量是目前育種工作的重點.組織培養技術是快速、高效繁殖山茶的重要途徑.山茶組織培養的方式主要為外植體材料\\(芽、莖段、葉片和子葉等\\)的愈傷組織 直 接 和 間 接 誘 導等[3,4].耐冬山茶未成熟胚胚狀體培養再生繁殖體系\\(也稱體胚培養\\)是通過胚狀體直接誘導或愈傷組織間接誘導,可在較短的時間內獲得再生頻率高的植株,成本低,有利于種質資源保存、大規模生產耐冬山茶及實現外源基因的遺傳轉化[5].相比直接誘導胚狀體方式,通過胚性愈傷誘導的胚狀體可形成數量較多的植株,其中胚性愈傷的形成是誘導胚狀體的關鍵環節.本實驗采用不同激素組合,對不同時期采集的耐冬山茶不同部位幼胚進行胚狀體和胚性愈傷誘導,分析最適宜產生胚狀體和胚性愈傷的條件,為耐冬山茶胚狀體再生繁殖體系奠定基礎.

1 材料與方法.

1.1 實驗材料.

實驗所用的耐冬山茶植株栽植于青島市植物園實驗田內,2012年4月進行異花授粉,8~9月分別采集授粉后15周、17周、19周和21周的幼果,以剝除果皮和種皮后分段的幼胚作為外植體.

1.2 培養方法.

1.2.1 不同實驗材料組合.

授粉后13周左右,耐冬山茶幼胚基本成型,可以進行分段培養.為排除胚芽生長的影響,分別將授粉后15周、17周、19周和21周的幼果內幼胚去除上端胚芽部分,留取中段和下端部分,每部分再平均分成4塊,接種于誘導培養基上進行培養.每瓶接種一類幼胚\\(4個小塊\\),每類幼胚接種10瓶.

1.2.2 不同激素配制組合誘導 培養基 的基本培養基為MS,附加蔗糖30g/L,瓊脂粉8g/L.培養基配方以誘導胚狀體為主進行設計,不同的激素組合如表1所示.培養基調pH至5.8,121℃滅菌20min.

表1誘導耐冬山茶胚狀體和胚性愈傷的激素組合.

1.2.3 外植體消毒和培養采來的幼果先用流水沖洗干凈,再小心剝出種子,自來水沖洗干凈后放入無菌水中.在超凈工作臺中,處理過的種子先用75%酒精浸泡20s,再用無菌水沖洗2遍,然后使用0.1%的HgCl2消毒浸泡7min,最后用無菌水沖洗5~6遍.將分段的幼胚接種于不同組合的培養基中,在培養溫度為25℃、光照光強為2500~3000lx的培養室中培養,光照時間為12h/d.每7d觀察一次,30d后統計產生胚狀體和胚性愈傷的數量及產生胚狀體/胚性愈傷的幼胚塊數量.

2 結果與分析

幼胚接種1周左右開始膨大,2周左右開始出現胚性愈傷,胚性愈傷呈現淡黃綠色,生長較一般的愈傷組織緩慢,質地松軟,表面有瘤狀凸起,細胞排列緊密.3周左右就能夠區分直接誘導的胚狀體和愈傷組織,此時的胚狀體基本發育到子葉胚階段,顏色為淡黃綠色或乳黃色\\(圖1\\).在對出現胚性愈傷和胚狀體的幼胚塊進行統計的基礎上,還進一步確定了產生這兩類組織的具體數量.其中胚性愈傷根據耐冬山茶中誘導出現的形態特點,以組團為單位進行了統計.

2.1 授粉15周后的胚狀體和胚性愈傷誘導

從表2可看出,對于胚狀體誘導率最高的組合為1.0mg/L 6-BA激素培養基對于末段幼胚誘導和1.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/L NAA誘導末段幼胚,最低誘導率出現在添加1.0mg/L IBA激素培養基對中段幼胚的誘導組合中.在對胚性愈傷誘導中,誘導率達60%以上的激素配方和幼胚部位組合包括5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA誘導末段幼胚和2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA、1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L 6-BA、0.5mg/L IBA誘導中段幼胚,1.0mg/L 6-BA對中段幼胚誘導率高達75%.

表明,較低濃度的6-BA及其與NAA組合對早期幼胚胚狀體誘導率效果較好,而6-BA與較低濃度IBA組合有利于胚性愈傷的誘導.

2.2 授粉17周后的胚狀體和胚性愈傷誘導

授粉17周后采集的幼胚接種后,對于胚狀體的誘導率最高的組合仍然是1.0mg/L 6-BA和1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA對于末段幼胚的誘導,但總體數量較授粉15周后接種的幼胚增多\\(表3\\).添加1.0mg/L 6-BA激素的培養基上誘導的末段誘胚和5.0mg/L 6-BA+ 0.5mg/L IBA誘導的中段幼胚所產生胚性愈傷的塊數最多,在6-BA+NAA的兩種激素組合中的培養基中和0.5mg/L IBA激素的培養基中對于胚性愈傷的誘導率最低.這再次證明了6-BA、NAA和IBA的不同組合對于耐冬山茶幼胚的作用效果差異明顯.

2.3 授粉19周后的胚狀體和胚性愈傷誘導.

和前兩次誘導胚狀體組合不同的是,19周接種的幼胚胚狀體數量除在有1.0mg/L 6-BA激素誘導的 末 段 幼 胚 中 最 高 外,在1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA激素誘導的中段和末段幼胚中也很高\\(表4\\).但胚性愈傷的誘導率總體上較前兩次的數量略有降低,最高誘導率出現在2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA激 素 組 合 的 幼 胚 中 段 部 位 和1.0mg/L 6-BA的幼胚末段部位.

2.4 授粉21周后的胚狀體和胚性愈傷誘導.

此階段對于胚狀體的誘導率表現趨勢和15、17周的類似,只是數量上有所上升,添加1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA激素的MS培養基對于末段幼胚的胚狀體誘導效果最佳,其次為1.0mg/L 6-BA的激素對于末段幼胚的胚狀體誘導可達45%以上,對胚狀體誘導率最低的激素組合為僅添加生長素的兩種不同濃度IBA的配方\\(表5\\).大于60%的胚性愈傷的誘導組合為5.0mg/L 6-BA+ 0.5mg/L IBA誘導末段幼胚和2.0mg/L 6-BA+ 1.0mg/L IBA誘導幼胚中段部位.3結論3.1接種時間對胚狀體和胚性愈傷的誘導.

從4個不同接種時期對于耐冬山茶的胚狀體和胚性愈傷的誘導情況來看,隨著幼果成熟時間的延長,8個不同的激素組合對于胚狀體的誘導率基本呈現上升的趨勢,這表明發育成熟度高的幼胚對于胚狀體的誘導能力較強.但胚性愈傷的誘導效果與幼果成熟度關系不太大,這可能與授粉后15~21周幼胚發育成熟度較一致有關.

3.2 激素對胚狀體和胚性愈傷的誘導.

耐冬山茶胚狀體在含有1.0mg/L 6-BA的培養基上,未成熟胚較易形成胚狀體,其中單獨添加1.0mg/L 6-BA的培養基和1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA組合的培養基總體對胚狀體的誘導率最高.濃度大于2.0mg/L 6-BA的培養基對于胚狀體形成不利.單獨添加IBA的培養基對于胚狀體誘導效果最弱.添加稍高濃度的6-BA+IBA的組合及低濃度的6-BA培養基對于耐冬山茶胚性愈傷的誘導效果最佳,2.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/LNAA的激素組合和0.5mg/L IBA對于胚性愈傷形成影響效果最低.由此可見,胚狀體誘導需要較低濃度細胞分裂素和生長素的協同作用,胚性愈傷的形成則需要稍高濃度的細胞分裂素的促進.

3.3 外植體部位對胚狀體和胚性愈傷的誘導

總體來看,耐冬山茶胚狀體在幼胚的末段部位發生較多,而胚性愈傷在幼胚的中段部位較易形成.

胚狀體一般一個幼胚段只有1~2個,但胚性愈傷在每個幼胚段上的數量呈組團狀分布,數量較多.胚性愈傷接種到體胚誘導培養基上,極易形成胚狀體,可以快速獲得大量的胚狀體再生植株.同時,研究中還發現幼胚表面形成的胚狀體較切口面為多,但胚性愈傷多在切口處形成.

4 討論

耐冬山茶果實成熟的時間為10月份左右,授粉12周以內的幼胚尚未凝固成型,不利于區分不同部位進行誘導.本實驗中授粉15~21周的幼果處于8月上旬至9月上旬,此期間幼胚已經成型,子葉表皮細胞分化能力較高,因此胚狀體的形成能力也較強.

植物組培過程中,褐化現象比較普遍,耐冬山茶在誘導胚狀體過程中未出現明顯褐化現象,但在幼胚切口邊緣的愈傷組織 呈現梅紅色,這可能與物種特異性有關,有待于進一步的解剖觀察分析[6].

在對 山 茶 屬 植 物 胚 狀 體 研 究 中,茶 梅 \\(C.sasanqua\\)、防 城 金 花 茶 \\(C.chrysantha var.longistyla\\)等多個物種胚狀體都是在1.0mg/L 6-BA +低濃度NAA的激素組合條件下易誘導發生,但發生率一般都在50%以下[7-9].這和本實驗對于胚狀體直接誘導的結果相似,只是物種不同,激素濃度有所差異.在對茶樹\\(C.sinensis\\)體胚研究中發現,在胚狀體誘導培養基中附加一些滲透調節劑,如500~1000mg/L甜菜堿,體胚的發生率會提高[10].實驗中,耐冬山茶胚性愈傷的誘導率普遍較高,間接誘導的胚性愈傷可以再進一步誘導為胚狀體,這比直接誘導胚狀體更能夠獲得更多的再生苗.在 對 金 花 茶 體 胚 愈 傷 組 織 誘 導 中,MS +1.5mg/L 2,4D +0.5mg/L KT的培養基中愈傷組織誘導率高,這與本實驗采用的組合差異有所不同,耐冬山茶中對于其他激素組合誘導培養基還有待于嘗試[11].目前山茶屬中對于其他物種胚性愈傷的誘導培養基配方報道較少,本實驗可以為山茶屬植物通過胚性愈傷誘導的胚狀體快速繁殖方式提供參考.

參考文獻:

[1]王仁卿,張治國,石竹,等.青島山茶的多樣性研究Ⅲ.生態學分析[J].山東大學學報\\(自然科學版\\),1999,34\\(1\\):109-116

[2]王奎玲.耐冬山茶種質資源研究[D].北京:北京林業大學博士學位論文,2006:25-26

[3]Ponsamuel J,Samson N P,Ganeshan P S,et al.Somatic embryo-genesis and plant regeneration from the immature cotyledonarytissues of cultivated tea\\(Camellia sinensis\\(L\\).O.Kuntze\\)[J].Plant CellReports,1996,16\\(3-4\\):210-214

[4]董慧慧,王奎玲,薛秋華,等.耐冬山茶愈傷組織誘導研究[J].福建林業科技,2007,34\\(3\\):135-138

[5]賴鐘雄,林莉.山茶屬植物體細胞胚胎發生研究進展[J].福建農林大學學報\\(自然科學版\\),2004,33\\(4\\):471-476[6]張志蘭.山茶花組織培養過程中的防外植體褐化試驗[J].