糖尿病視網膜病變\\( diabetic retinopathy,DR\\) 是糖尿病的最主要并發癥之一,是嚴重致盲性眼病; 視網膜Müller 細胞是 DR 的主要參與細胞.而 ApoAI 是高密度脂蛋白\\( HDL\\) 的主要載脂蛋白,其在膽固醇逆向轉運、抑制低密度脂蛋白\\( LDL\\) 的氧化修飾、前列環素的穩定、保護血管內皮細胞以及穩定細胞膜結構中發揮重要作用[1].最近研究表明,ApoAI 是主要的抗粥樣硬化因子[2].國內已有報道中國糖尿病人群 ApoAI顯著低于健康人群[3],而 apoB 與 ApoAI 的比值顯著高于健康人群[4],作者擬研究 ApoAI 對 Müller 細胞增殖與凋亡的影響,以期探討視網膜 Müller 細胞參與DR 的始動因素.
1 材料與方法
1. 1 人視網膜 Müller 細胞的原代培養
按朱茂麗等[5]報道的方法稍加改進進行細胞培養: 取角膜移植后的眼杯\\( 取自于蘇州大學第三臨床醫學院眼科\\) ,自鋸齒緣后 1 ~2 mm 處環形剖開眼球,去除眼前部組織及玻璃體,留后半眼球壁于 DMEM 培養液中,輕輕剝取視網膜組織,將視網膜組織放于含DMEM 培養基的一次性塑料培養皿中,在解剖顯微鏡下將視網膜組織剪成約 1 mm ×1 mm 大小的組織塊制成組織塊懸液,離心棄上清,加入 5 倍組織塊體積的0. 25% 的胰酶懸浮組織塊,細胞培養箱放置 5 min 后取出加入等體積的 20% FBS 的 DMEM 培養液后用移液器輕輕吹打 10 次,離心棄上清,加入 20% FBS 的DMEM 培養液再次制成組織塊懸液接種于培養瓶中,置于恒溫恒濕培養箱\\( 37 ℃,體積分數為 5CO2\\) 中培養,開始 1 周不換液,若培養液變黃則小心用移液器吸出部分培養液后加入新鮮培養液,待 1 周后細胞爬出后換液,見 80%以上的細胞融合以后傳代培養.經免疫組化鑒定培養出的細胞為視網膜 Müller 細胞.
1. 2 實驗分組與實驗方法以 P3代對數生長期的人視網膜 Müller 細胞用于實驗,當 Müller 細胞達 80% 以上融合狀態時予以0. 25% 胰蛋白酶消化,用含 20% FBS 的 DMEM 培養液制成細胞懸液接種至 6 孔培養板中,置于飽和濕度、37 ℃ 、體積分數為 5% % CO2培養箱中孵育.24 h 后取出 6 孔培養板,小心吸棄原培養液,用無 FBS 的DMEM 培養液漂洗兩次,不同 ApoAI 濃度組中分別加入濃度為 0、0. 01、0. 1、1 μg·ml- 1的 DMEM 培養液3 ml,置于飽和濕度、37 ℃ 、體積分數為 5% % CO2培養箱中繼續孵育 24 h.
倒置顯微鏡下觀察各組 Müller 細胞形態.流式細胞術檢測 Müller 細胞的細胞周期,0. 25% 胰酶消化6 孔板中的細胞制成單細胞懸液并收集到流式管中,PBS 洗兩次以除去其中的培養液和胰酶等物質,然后使用美國BD 公司的DNA 異倍體染色試劑盒,按照說明書依次加入 A、B、C 3 種試劑后上機檢測.流式細胞術檢測 Müller 細胞的凋亡,0.25%胰酶消化六孔板中的細胞制成單細胞懸液并收集到流式管中,PBS 洗兩次以除去其中的培養液和胰酶等物質,將細胞懸液離心棄上清后加入 195 μl Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞,加入 5 μl Annexin V-FITC 輕輕混勻,室溫\\( 20 ~25 ℃ \\) 避光孵育 10 min.1 000 g 離心 5 min,棄上清,加入190 μl Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞.加入10 μl 碘化丙啶染色液輕輕混勻,冰浴避光放置,隨即進行流式細胞儀檢測.熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞形態,按上述步驟處理細胞最后一步不進行流式細胞儀檢測,而是離心收集細胞后用 50 ~100 μl Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞,涂片后于熒光顯微鏡下觀察.
1. 3 統計學處理
實驗數據均以均數 ± 標準差表示,應用 SPSS 統計軟件進行單因素方差分析,以 P <0. 05 表示差異有統計學意義.
2 結 果
2. 1 不同藥物濃度組 Müller 細胞形態.
各組 Müller 細胞呈典型的多角形,大小均勻、邊界清晰、形態無明顯差異.見圖 1.
2. 2 不同藥物濃度組人視網膜 Müller 細胞的細胞周期分布采用單因素方差分析的統計方法,藥物處理后G1期細胞百分比無明顯變化\\( F =0. 432,P > 0. 05\\) ,S 期細胞百分比明顯增多 \\( F = 11. 007,P < 0. 05\\) ,G2期細胞百分比明顯降低\\( F = 20. 350,P < 0. 05\\) .見表 1.
2. 3 Annexin V-FITC /PI 細胞凋亡的檢測結果
0、0. 01、0. 1、1 μg·ml- 14 個不同濃度組別人視網膜 Müller 細胞的凋亡數目百分比分別為\\( 10. 19 ±3. 49\\) % 、\\( 12. 90 ± 2. 35 \\) % 、\\( 9. 86 ± 0. 50\\) % 、\\( 13. 91 ±4. 83\\) %,采用單因素方差分析的統計方法,藥物處理后細胞凋亡百分比差異無統計學意義\\( F =1. 166,P = 0. 381\\)2. 4 熒光顯微鏡下晚期凋亡和早期凋亡細胞的形態熒光顯微鏡下 4 組凋亡細胞的數目及形態未見明顯差異,見圖 2.
3 討 論
DR 是糖尿病最常見而嚴重的并發癥之一,近幾年國內外學者研究認為,Müller 細胞在視網膜血管病變之前其形態結構和生理功能就發生了變化,Müller細胞的這些變化在 DR 的發生發展中起重要作用[6].
Müller 細胞是視網膜的主要神經膠質細胞,該細胞從視網膜的內界膜延長至外界膜,貫穿于視網膜感覺神經全層,發揮著穩定視網膜的復雜結構、提供定向支架、從結構和功能上支持視網膜神經元和血管、阻止異常光感受器細胞遷移入視網膜下間隙的功能[7].因此,探討微環境內外因素對視網膜 Müller 細胞的影響有利于我們認識該細胞在 DR 過程中的作用.
ApoAI 主要是由小腸和肝臟合成的一種載脂蛋白,其主要分布在血漿乳糜顆粒\\( CM\\) 、HDL2、HDL3中.成熟的人 ApoAI 由 243 個氨基酸組成,相對分子質量為 28 300.ApoAI 在膽固醇逆向轉運、抑制 LDL的氧化修飾、前列環素的穩定、保護血管內皮細胞以及穩定細胞膜結構中發揮重要作用[8].國內已有報道中國糖尿病人群 ApoAI 顯著低于健康人群,而 apoB 與ApoAI 的比值顯著高于健康人群[9].
本實驗中,加入 ApoAI 后處于 S 期的細胞比例明顯增加,而相應的 G2期細胞明顯減少,并且隨著ApoAI 濃度的增加這種趨勢更加明顯.說明 ApoAI 可以抑制 Müller 細胞的增殖,使細胞增殖過程阻滯在 S期和 G2期之間.因此,ApoAI 可能是通過阻滯細胞的分裂來抑制細胞的增殖.
在本次細胞凋亡實驗中,加入 ApoAI 的流式結果顯示細胞凋亡比例沒有明顯變化,說明 ApoAI 對Müller 細胞的凋亡無明顯作用,也表明 ApoAI 對Müller 細胞的作用應該是通過其它路徑,即可能通過阻滯細胞的分裂來抑制細胞的增殖.
綜上所述,ApoAI 可以抑制人視網膜 Müller 細胞的增殖,且這種抑制作用隨著 ApoAI 濃度的增加而增強; ApoAI 對細胞凋亡無明顯作用.由此我們可以推斷,糖尿病狀態下由于 ApoAI 的顯著降低以及 apoB 與ApoAI 的比值顯著增高,可能解除了對于視網膜Müller 細胞抑制作用,從而促進了 DR 的發生.
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