精原干細胞\\(spermatogonial stem cells, SSCs\\)是精了發生的前體細胞，也是雄性個體體內唯一可以終生保持白我更新和增殖并將遺傳信息縱向傳遞給后代的特殊干細胞群體。多年來，SSCs在細胞生物學、內分泌學和生殖醫學的極大發展前景一直被人們所重視。深入研究SSCs的相關生物學特性有助于闡明精了發生的機制，對SSCs的進一步應用研究也具有重要意義。因此，SSCs的體外培養也成為了當今生物科學研究的熱點問題。

1994年，Brinster等[2-3]建立了SSCs移植技術，此后SSCs的研究便得到了空前的發展。近年來，又建立了小鼠SSCs的體外長期培養和增殖方法[4-5]隨后，科學家們又建立了大鼠SSCs的體外培養和增殖方法。然而，在培養過程中對SSCs的生長過程卻并不完全了解。能否建立一種方法可以對SSCs進行少量細胞的培養并保證較高的成活率，直接得到SSCs的細胞簇。在探討此問題的過程中，用微滴培養技術培養SSCs引起了我們的興趣[6]。

微滴培養技術最早始于Brinster在1963年所創建的液體石蠟覆蓋微滴培養法，其最早應用于卵了和胚胎的培養，這種用石蠟油覆蓋的小滴培養對卵了和胚胎細胞的觀察以及收集定量性的數據是特別有幫助的。同時，在單位體積中培養適當數量的細胞，能夠保證細胞正常生長，維持培養液滴正常的滲透壓。微滴法從此開始被許多研究者采用，現在也成為許多體外受精項目中的標準操作[8]。最近，日本研究組將微滴培養技術成功應用于小鼠SSCs的體外增殖培養[9]。研究人員使用小鼠胚胎成纖維細胞作為滋養層細胞，利用顯微操作技術將SSCs轉移到微滴中進行培養，獲得了成功。研究指出，在SSCs的體外培養過程中，微滴培養技術的進一步成熟會使我們更深刻地了解SSCs的體外生長機理和白我更新及分化的條件。

大鼠是實驗室中研究得較多的一種實驗動物，在醫藥以及生物學領域已有超過白萬篇科研文獻是以大鼠為實驗動物的。然而，目前還沒有較好的方法建立轉基因大鼠，從而限制了大鼠的應用。小鼠研究已經顯示，將轉基因的SSCs移植到受體鼠肇丸，能傳遞供體的遺傳信息，產生轉基因的后代.將小鼠SSCs操作技術應用于大鼠研究，已經繁育出轉基因大鼠.但是，大鼠SSCs操作技術的核心部分之一，即SSCs的長期培養，仍然存在技術難點。本研究對大鼠SSCs微滴培養技術進行探索，用少量數目明確的大鼠SSCs進行體外培養，實現了大鼠SSCs的擴增。免疫熒光雙標記染色和體外誘導分化分析鑒定顯示，微滴培養技術能維持大鼠SSCs的標記分了表達特性和分化能力，適用于少量大鼠SSCs的增殖培養。

1材料與方法

1.1材料

Wistar-Iamichi大鼠由內蒙古大學動物實驗中心國家二級清潔型動物房繁育。本研究的大鼠SSCs由本實驗室提供[l3]。實驗中采用了p一琉基乙醇\\(SERVA\\), Amphotericin B\\(BBI\\)、鏈霉素\\(BBI\\),青霉素\\(日本和光株式會社\\)、MEMa\\(GIBCO\\),DMEM/F 12\\(GIBCO\\)·絲裂霉素\\(浙江海正藥業\\)、丙酮酸鈉\\(日本和光株式會社\\)、谷氨酞胺\\(日本和光株式會社\\)、石蠟油\\(Sigma\\), EDTA\\(上海生工生物工程有限公司\\)、Trpsin\\(AMRESCO\\)、胎牛血清\\(FBS，天津瀕洋生物\\)、BSA\\(Sigma\\)、正常山羊血清封閉液\\(BOSTER\\), Hoechst\\(SIGMA\\), Triton-x1 oo}sIGMA\\)、卵泡刺激素\\(FSH，寧波第二激素廠\\)、肇酮\\(寧波第二激素廠\\)、60 mm培養皿\\(CORNING\\),12孔板\\(CORNING\\)、無血清細胞凍存液\\(Sigma\\),細胞生長因了GDNF\\(PROSPEC\\), Gfral\\(R&DSYSTEMS\\), bFGF\\(PROSPEC\\)，其他化學試劑均為國產分析純。

大鼠SSCs染色實驗所用的一抗:抗CDH1抗體\\(Santa Cruze\\)、抗OCT4抗體\\(Abc am\\)、抗PLZF抗體\\(Santa Cruze\\)、抗Thyl抗體\\(Santa Cruze\\)、抗GFRaI抗體\\(Santa Cruze\\);二抗:CY3偶聯的山羊抗小鼠IgG\\(碧云天生物技術有限公司\\)、FITC偶聯的山羊抗兔IgG\\(碧云天生物技術有限公司\\)。SSCs分化后染色所用一抗:抗Scp3抗體\\(Santa Cruze\\);二抗:CY3偶聯的山羊抗兔IgG\\(碧云天生物技術有限公司\\)。

細胞核染料Hoechst33342\\(Sigma\\) o1.2大鼠精原干細胞的分離純化及鑒定用2224 d的大鼠，按Zhang等[l4]的方法分離純化制備大鼠SSCs。大鼠精原干細胞的體外培養參照Kubota等的方法進行，用絲裂霉素處理的STO細胞做為滋養層，用無血清培養液進行精原干細胞培養。

1.3微滴的制備

采用60 mm培養皿作為微滴承載器皿，每培養皿12個微滴，每個微滴含有20 pL SSC培養液[14-16]。每個微滴內接種絲裂霉素C處理的STO細胞\\(1 }2\\) X 106}mL作為滋養層細胞[l7]，在液滴表面覆蓋3 mL石蠟油。

用同樣方法制作6個微滴培養皿。在37 0C, 5% COz的飽和濕度細胞培養箱\\(BINDER\\)中過夜培養后，按文獻[13]的方法利用顯微操作技術將大鼠SSCs定量轉移至培養皿的微滴中進行微滴培養。

1.4大鼠SSCs的微滴培養

\\(1\\)將確定數目的大鼠SSCs轉移至微滴中進行培養:利用顯微操作技術將。、5, 8, 10, 20, 40個SSCs分別轉移至6個60 mm培養皿的72個微滴中，每個培養皿的微滴內只接種相同數目的細胞，每組有12個重復數據。加入細胞后，在微滴內連續吹吸8次從而使微滴內的SSCs均勻接觸滋養層細胞。將培養皿置于37 0C, 5% COz的細胞培養箱進行細胞培養。每隔2d更換SSCs培養液。必要時補充適量的滋養層細胞。

\\(2\\)定時對微滴內的細胞進行觀察并照相:每次換液時用Nikon TE2000-U倒置顯微鏡對培養的SSCs進行觀察照相。培養至一個月時，一部分微滴中的SSCs用于細胞固定和免疫熒光染色鑒定，其余微滴中的SSCs收集起來用于體外誘導分化實驗。

1.5免疫熒光雙標染色鑒定

張巖等證實，CDH1也可以作為大鼠SSCs的標記分了，可以用于大鼠SSCs的鑒定。因此，本實驗用CDH1作為主抗體，與其他四種抗體\\(OCT4,PLZF, Thy120, Gfra12\\)組合成為四組進行免疫熒光雙標染色鑒定，即OCT4-CDH1, PLZF-CDH1,THY1-CDH1, Gfral-CDH1。取在微滴連續培養一個月的SSCs，小心吸去微滴內的培養液，用4%多聚甲醛對微滴內的細胞室溫固定1 h, DPBS洗滌5次，隨后用正常山羊血清對細胞進行室溫封閉處理30 minx封閉后向四個微滴中加入第一種一抗\\(CDH1\\)\\(1:80稀釋\\),40C過夜。吸去一抗，用DPBS洗滌5次以除去未結合的IgG，再向4個微滴中加入Cy3偶聯的二抗\\(1:100稀釋\\)\\(Goat-anti-mouse\\)，室溫孵育30 min，用DPBS洗滌5次以除去未結合的二抗IgG。第二種一抗如果其抗原是胞內蛋白就要進行通透處理。隨后向4個滴內分別對應加入OCT4, PLZF, T場1,Gfral四種一抗，4 0C過夜，用DPBS洗滌5次以除去未結合的IgG，加入FITG偶聯的二抗\\(\\(1:100稀釋\\)\\(goat-anti-rabbit\\)共孵育30 min，使用DPBS洗滌5次，再對4個滴進行Hoechst33342\\(1:1 000稀釋\\)染色，DPBS洗滌5次后加入新鮮的DPBS，用Nikon TE2000-U倒置熒光顯微鏡進行觀察照相。

1.6 SSCs的體外誘導分化首先，將12孔板的兩個孔標記為A, B，用0.2gelatin處理，培養板置于37 0C恒溫培養箱1h，然后吸去gelatin處理液，用PBS洗3遍。在A, B兩孔中分別加入山羊肇丸支持細胞1 X 106/mL\\(Sertoli cells，由本實驗室提供[}ZZ'\\)，在含10% FBS的DMEM/F 12培養液中，37 0C, 5% COz培養過夜。緩慢吸出支持細胞培養液，向A孔中加入微滴培養法所獲得的大鼠SSCs, B孔作為對照組只有支持細胞。將12孔板進行整板離心，用水平離心轉頭3 000 r/min，使SSCs貼在底部的支持細胞上。溫和地吸干培養液，每孔加入含0.3%低熔點瓊脂糖的分化誘導液\\(DMEM/F 12,10% FBS\\)、青霉素\\(100 U/mL\\)、鏈霉素\\(100 pg/mL\\), \\(3-琉基乙醇\\(0.1 mmol/L\\)、兩性霉素B\\(0.125 pg/mL,SCF 100 ng/mL\\) 500 pL}z3}，斜置于10 0C水浴中15 min使瓊脂糖凝固。凝固后再每孔添加500 pL分化誘導液，放入37 0C, 5% COz的恒溫培養箱中培養。每隔2}3 d換一次培養液，并每天進行觀察。

對分化培養lOd的細胞進行Scp3免疫熒光染色分析。吸去培養皿中的培養液，使用4%多聚甲醛對兩組細胞室溫固定1 h, DPBS洗滌3次，使用Triton-X 100對A, B兩孔細胞進行通透處理后，加正常山羊血清封閉液室溫處理30 min，封閉后向兩孔中加入一抗\\(Scp3\\)\\(1:50稀釋\\)，4 0C過夜。吸去一抗，使用DPBS洗滌3次以除去未結合的IgG，再向兩孔中加入Cy3偶聯的二抗\\(1:200稀釋\\)\\(Goat-anti-rabbit\\)，室溫與細胞共孵育30 min，使用DPBS洗滌3次，再對兩個孔進行Hoechst33342核染色，DPBS洗滌3次后加入新鮮的DPBS，用Nikon TE2000-U熒光倒置顯微鏡進行觀察照相。

2、結果

2.1大鼠SSCs分離純化培養結果

大鼠SSCs經過單細胞懸液制備、差別貼壁純化，純度達到90%以上。用絲裂霉素C處理的STO細胞作為滋養層，用已知成分的無血清培養液對大鼠SSCs進行繼代培養一年以上，傳代達30代以上。

2.2連續一個月微滴培養大鼠SSCs的增殖狀況

用30代以上的大鼠SSCs進行大鼠微滴培養研究。通過微滴換液培養、觀察、照相等實驗操作，對微滴培養的大鼠SSCs進行觀察記錄。其中不同接種數目的全部微滴內的SSCs均實現擴增，尤其是數量最少的5個細胞的微滴同樣實現SSCs擴增，并均能在微滴內的增殖培養達一個月，通過觀察記錄了微滴內SSCs連續增殖的狀況\\(圖1\\)，證明該方法所培養的SSCs可以實現正常增殖。

2.3免疫熒光雙標染色鑒定

采用四組免疫熒光染色對在微滴內培養一個月的大鼠SSCs進行免疫熒光雙標記染色。所用抗體組合為CDH1-OCT4, CDH1-PLZF, CDH1-T場1,CDH1-Gfral。染色表明，采用微滴培養的大鼠SSCs表達其特異的標記分了CDH1, OCT4, PLZF,Thy 1和Gfral o滋養層細胞\\(黃色箭頭\\)的染色結果為陰性\\(圖2\\)，說明大鼠SSCs經過微滴培養一個月后仍然保留SSCs標記分了。

由微滴內成功實現SSCs的細胞簇的生長和分化，我們可以發現微滴確實可以為細胞生長提供較理想的生長環境，并且石蠟油的覆蓋也明顯防止了液體蒸發。

2.4微滴內大鼠SSCs的體外分化

為了確認微滴培養法所獲得的大鼠SSCs是否可以在體外進行分化，本實驗將體外分離純化的山羊肇丸支持細胞和微滴培養法獲得的大鼠SSCs進行共培養，并定時進行觀察比較。在肇丸支持細胞完全貼壁后加入大鼠SSCs，在加入SSCs的24 h內貼在皿底精原細胞的數量逐漸減少。培養24 h后，精原細胞數量基本穩定，之后每隔2-3 d置換一次培養液。培養3-4 d時，較少看到SSCs o培養至8d觀察到有較多精母細胞成批出現\\(圖3\\)。由于精母細胞體積較大，往往大于15 um，其中初級精母細胞多大于20 um，所以很容易辨認\\(圖3\\)。利用定時多次拍照技術可以對比發現，精母細胞有較明亮的細胞質，有的有細胞附器，能做順時針或逆時針旋轉，但沒有或少有位移。這個細胞形態及運動行為與肇丸組織塊共培養體系的精母細胞觀察結果相一致[24-25]SCP3為精原干細胞減數分裂的標記蛋白。使用SCP3抗體對己分化的細胞進行免疫熒光染色鑒定，證明微滴培養法所獲得的SSCs經過體外誘導分化能夠轉變為精母細胞\\(圖4\\)03討論在整個精了發生過程中，精了的產生是一個高度復雜的細胞分化過程，需要整個肇丸內的各種細胞的精確調控。這個復雜的過程就開始于肇丸基底膜上的一群數量很少的SSCs。在成年小鼠肇丸內的全部生殖細胞中，僅有0.03%是SSCs.因此，對SSCs進行培養是從體外研究SSCs及精了發生過程調控的關鍵一步。

Brinster}']于1963年用液體石蠟覆蓋微滴培養法培養卵了和胚胎取得成功。本實驗中使用的微滴培養法，實現了較少接種數目的大鼠SSCs的增殖，尤其是數量少至5個細胞的微滴內同樣可以實現大鼠SSCs擴增。這足夠說明微滴培養體系對于大鼠SSCs的體外培養是可行的，而較少接種數目的大鼠SSCs在常規的培養方法中卻難以實現擴增。這種在微滴中接種較少數目的細胞就可實現該細胞的增殖將會為SSCs的進一步研究提供新的技術支撐，同時也為其他物種SSC的培養提供新的選擇。

E一c adherin\\(CDH 1 `6、OCT4、PLZF、Thy120, Gfra12作為大鼠SSCs標志分了已被報道本實驗使用CDH1作為大鼠SSCs的特異性檢測主抗體，其在體內和體外都實現了特異性表達[6]。最近報道證實，CDHI也被稱作E-c adherin\\)是小}}SSCs的特異表面標記基因. CDH1是一個特異的在上皮組織中表達的跨膜糖蛋白，被證實在胚胎形成、通過細胞問連接復合物形成組織結構和產生細胞極性中起作用[28]。本研究組張巖等[l6]也通過大量的實驗闡明CDH1可以作為大鼠SSCs的標記分了，用于大鼠SSCs的鑒定。本研究用這些標記分了對培養長達一個月的SSCs進行雙標免疫熒光染色鑒定，而這些SSCs特異標記蛋白在滋養層細胞內卻恰好不會表達。結果證明，微滴培養法對大鼠SSCs的標記分了表達特性不會產生負面影響，培養31 d后，大鼠SSCs仍維持表達精原干細胞標記分了。

為了證實微滴培養所得的大鼠SSCs仍具備分化潛能，將體外分離純化的山羊肇丸支持細胞和微滴培養法獲得的大鼠SSCs進行共培養。開始觀察的3}4 d大鼠SSCs數量減少很快。這與之前的研究結果很類似，可能是由于細胞凋亡導致的，另外造成這種情況的原因也可能是有SSCs進入分化階段便與支持細胞脫離而漂浮進入培養液里，導致因更換培養液而流失。還有，該體外誘導分化體系不能提供接下來的精了形成所需的其他激素和微環境，所以分化后的精母細胞數量隨著時問的延長而減少。在培養lOd后對分化為精母細胞的大鼠SSCs的成功染色證明了微滴培養法所獲得的SSCs仍具有原本的分化潛能，能夠分化為精母細胞。在精母細胞SCP3染色中，SCP3的高表達不出現在細胞核中，在其他物種如山羊的實驗中也發現有類似情況。這可能是由于SCP3在內質網合成后，還沒有大量轉運到細胞核;或者可能是在現有的體外培養條件下，SCP3轉運到細胞核存在某些障礙，尚需要做進一步的研究。

通過實驗發現，微滴培養法對大鼠SSCs的體外培養過程實現了定期觀察，便于研究SSCs在液體微滴內的相對適宜培養條件。采用常規的培養皿培養系統雖可對SSCs進行體外較多數量的培養，但是這種方法難以觀察SSCs的個體生長過程。此外，隨著研究的深入，相信追蹤到單個SSCs的詳細生長過程在下一步工作中也會實現。同時，微滴培養法可以大量節省實驗用細胞和生長因了等實驗耗材，不僅可以減少大量的實驗成本，而且可以廣泛被其他相關試驗借鑒。

在實驗研究過程中我們體會到，微滴培養體系具有一定的優點:覆蓋的石蠟油不僅可避免細胞染和培養液蒸發的損失，還起到了穩定pH的作用。研究表明，覆蓋油層還可以起到對有毒物質洗滌的作用[30]。同時，國內外專家已經開始研究如何更好地控制SSCs體外的培養條件，如水分蒸發、溫度、 pH控制、有毒物物質排除等一系列問題，微滴培養技術可以為SSCs生長創造更好的條件。

綜上所述，本實驗利用微滴培養法建立了大鼠SSCs的體外培養體系。在微滴內接種較少數量的SSCs\\(本實驗中最小接種數為5\\)也可以實現擴增，從而為今后SSCs的培養及擴增提供了新的途徑，為以后SSCs特性的研究提供更加準確和便利的條件。對SSCs免疫熒光雙標染色和成功誘導體外分化為精母細胞，證明該方法不會改變SSCs的標記分了表達特性，可以獲得具有分化潛能的大鼠SSCs。這一培養方法的建立不但為其他物種SSCs的培養提供了借鑒，所獲得的SSCs也將為再生醫學和生物學相關領域的研究提供了技術平臺。

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