一、 引 言
近年研究表明,表皮與真皮的相互作用,特別是角質形成細胞\\(human keratinocytes,HKC\\)與成纖維細胞\\(human fibroblasts,HFB\\) 的相互作用,在促進組織生長、維持組織內環境穩態、創傷愈合及瘢痕形成等方面具有極其重要的作用[1~4] .隨著研究的深入,人們發現 HKC 影響 HFB 分泌膠原蛋白;反之,HFB 通過旁分泌的形式促進 HKC 增殖[5],這兩種細胞的相互作用對傷口的愈合及再上皮化均有明顯的調控作用[6,7].增生性瘢痕是人體皮膚創傷修復過程中的常見疾病,主要以成纖維細胞的過度增生及細胞外基質的過度沉積和降解不足為特征,嚴重影響患者的身體和心理健康.HFB 是創傷修復過程中真皮的主要功能細胞,近年來,HFB與增生性瘢痕的關系已成為研究的熱點.
通過外部加壓來抑制瘢痕形成的加壓療法自20世紀70年代以來在臨床上得到了廣泛的認可和應用,但是,其作用機理研究中有關壓力下HKC 對 HFB 的作用研究相對較少.為此,我們通過自行研制的可控壓力密閉細胞培養裝置,初步探討氣體壓力下HKC 上清液對 HFB 的生物學作用.材料和方法主要材料DispaseⅡ購自瑞士 Roche 公司,CollagenⅡ、胰蛋白酶、EDTA、MTT、DMSO 購自美國Sigama公司,人角質形成細胞培養基K-SFM、胎牛血清FBS購自美國Gibco公司,DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司,羥脯氨酸測試盒購自南京建成生物工程研究所,兔抗人角蛋白K19單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司,羊抗兔SABC即用型試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司.
氣體壓力裝置的設計可控壓應力密閉容器的工作原理是:將95%空氣、5% CO2的混合氣體經 0.22 μm 濾器過濾后充入可控壓應力密閉容器,通過控制儲氣罐上的氣體流量計及密閉容器上的進、出氣口開關,使密閉容器內的氣體壓力穩定在實驗需要設定的壓力值,通過密閉容器上方的壓力表顯示容器內的氣體壓力.該裝置易操作,安全性、可靠性高.實驗時,將種植有細胞的器皿放入密閉容器中,然后將密閉容器放到 37℃的 CO2孵育箱里.無壓力對照組放進同一個 CO2孵育箱.
二、細胞培養及 HKC 的鑒定
細胞提取和培養
取健康漢族成人包皮環切術后的皮膚組織\\(由太原東方醫院提供,患者具有知情權\\),用含青、鏈霉素的 PBS 徹底清洗,無菌條件下去除皮下脂肪、血凝塊等雜物,表皮面朝上,0.25% DispaseⅡ4℃過夜分離表皮和真皮,采用胰酶消化法提取 HKC,用 K-SFM 培養HKC.采用膠原酶消化法原代培養 HFB,用含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培養基培養HFB,每隔 1~3 d 換液一次.
待原代 HKC 生長融合至 60%時,換為無細胞因子 EGF 與 BPE 的 HKC 專用培養基K-SFM,培養 48 h 后收集上清液,保存于 4℃備用.使用時,以 DMEM 稀釋配置為 50%濃度.待原代 HFB 生長融合至 80%后,用含 0.02% EDTA 的 0.25%胰蛋白酶按 1∶3 比例傳代.本實驗使用第三代生長狀態良好且處于對數增殖期的細胞.
HKC鑒定
待原代 HKC 生長融合至 80%時,用含 0.02% EDTA 的 0.25%胰蛋白酶消化細胞,以每孔104個接種于96 孔板,采用人角蛋白 K19 對 HKC 進行鑒定.細胞經 4%甲醛溶液固定后,參照文獻[8]按試劑盒說明書應用 SABC 法、DAB 顯色及蘇木精復染法,顯微鏡下觀察HKC.
實驗分組HFB以2×104個密度接種于 24 孔板 24 h 后,用 DMEM 與 HKC 上清液 \\(1∶1\\) 混合液培養,并以DMEM 與 K-SFM \\(1∶1\\) 混合液培養的 HFB 為對照組,培養 24 h 后,部分細胞用3.4 kPa 氣體壓力分別加載 5 h 或 10 h,另一部分細胞無壓力培養 5 h 或 10 h 作為對照組,實驗分為4 組.A 組:K-SFM 與 DMEM \\(1∶1\\) 混合液及無壓力加載培養的 HFB;B組:HKC 上清與 DMEM \\( 1 ∶1\\) 混合液及無壓力加載培養的 HFB; C 組: K-SFM 與DMEM \\(1∶1\\)混合液及加載3.4 kPa氣體壓力培養的HFB;D組:HKC上清與DMEM\\(1∶1\\)混合液及加載3.4 kPa氣體壓力培養的HFB.
三、 MTT法測定成纖維細胞的增殖情況
在3.4 kPa氣體壓力加載5 h或10 h后,各組細胞每孔中加入MTT \\(5 g/L\\) 50 μl,每組重復5孔\\(n=5\\),37℃、5% CO2孵育箱培養4 h 后,加入 DMSO 150 μl,振蕩 15 min 直至結晶物完全溶解.
在酶聯免疫檢測儀上測定各組HFB的吸光值\\( OD值\\),檢測波長為490 nm,記錄結果.OD值代表活細胞的相對數量,OD值增大,表明活細胞數量增多;反之,表明活細胞數量減少.
羥脯胺酸比色法測定上清液中膠原蛋白的分泌量
在 3.4 kPa 氣體壓力加載 5 h 或 10 h 后,收集各組上清液 0.5 ml 于試管中,每組重復 3孔\\(n=3\\),嚴格按照試劑盒操作說明書測定各組上清液中羥脯氨酸在 550 nm 處的吸光值\\(OD值\\),并根據公式計算羥脯氨酸含量,間接反映各組 HFB 膠原蛋白的含量.計算公式為:羥脯氨酸含量\\(μg/mL\\) = [\\(測定管吸光度 - 空白管吸光度\\) / \\(標準管吸光度 - 空白管吸光度\\)] ×標準管含量×水解液總體積\\(ml\\) /取樣量\\(ml\\).
其中,HKC 上清液與 DMEM\\(1∶1\\)混合液培養 HFB 組,以 HKC 上清液與 DMEM \\(1∶1\\) 混合液為空白;K-SFM 與DMEM \\(1∶1\\)混合液培養 HFB 組,以 K-SFM 與 DMEM \\(1∶1\\) 混合液為空白.
四、統計學處理
實驗結果以 x±s 表示,采用 SPSS 19.0 統計分析軟件以單因素方差分析數據,檢測各組之間是否存在差異,P<0.05為具有統計學差異,圖表采用 Origin 8.0 軟件制作.
五、 結 果
細胞培養及 HKC 的鑒定
培養的表皮細胞接種 24 h 后,可見部分細胞貼壁,細胞呈圓形、三角形或橢圓形,貼壁 3 d 可以形成小的集落,10 d 左右細胞融合成片,呈現典型的鋪路石樣排列 \\(如圖 1\\).經兔抗人 K19 免疫細胞化學染色顯示:細胞漿內 K19 染色陽性,呈棕黃色,襯染的核為藍色\\(如圖 2\\),說明所提取的人表皮細胞為 HKC.消化法培養的 HFB 剛接種時呈球形,24 h 左右大部分細胞開始貼壁生長,7 d左右融合.
倒置相差顯微鏡下觀察,可見細胞呈長梭形生長,排列緊密,呈典型漩渦狀走行\\(如圖3\\).
各組中成纖維細胞的增殖情況
經單因素方差檢驗,FOD=31.542,dfOD=7,如圖 4 所示,同一時間點不同組之間進行比較發現:HKC 上清液作用 5 h 后,B 組 OD 值顯著高于 A 組 \\(P<0.05\\),其它組之間無統計學差異;HKC 上清液作用 10 h 后,B 組 OD 值顯著高于 A 組 \\(P<0.05\\),D 組 OD 值顯著高于 C 組 \\(P<0.05\\),其它組之間無統計學差異.
如圖 5 所示,同一時間點不同組之間進行比較發現:3.4 kPa 氣體壓力作用 HFB 5 h后,C 組 OD 值較 A 組顯著下降 \\(P<0.05\\),D 組 OD 值較 B 組顯著下降 \\(P<0.05\\),其它組之間無統計學差異;3.4 kPa 氣體壓力作用 HFB 10 h 后,C 組 OD 值較 A 組顯著下降 \\(P<0.05\\),D 組 OD 值較 B 組顯著下降 \\(P<0.05\\),D 組 OD 值較 A 組顯著上升 \\(P<0.05\\),其它組之間無統計學差異.同一組不同時間點比較發現:C 組 3.4 kPa 氣體壓力作用 10 h 較 5 h的OD值顯著下降\\(P<0.05\\),其它組之間無統計學差異.
各組上清液中膠原蛋白的分泌量
經單因素方差檢驗,Fcollagen=16.874,dfcollagen=7,如圖 6 所示,同一時間點不同組之間進行比較發現:HKC 上清液作用 5 h 后,B 組 HFB 膠原蛋白合成量顯著高于 A 組 \\(P<0.05\\),其它組之間無統計學差異;HKC 上清液作用 10 h 后,B 組 HFB 膠原蛋白合成量顯著高于A 組 \\(P<0.05\\),D 組膠原蛋白合成量顯著高于 C 組 \\(P<0.05\\),其它組之間無統計學差異.
如圖 7 所示,3.4 kPa 氣體壓力作用 HFB 5 h 后,各組之間無統計學差異;3.4 kPa 氣體壓力作用 HFB10 h 后,C 組 HFB 膠原蛋白合成量較 A 組顯著下降 \\(P<0.05\\),D 組膠原蛋白合成量較 B 組顯著下降 \\(P<0.05\\),D 組 HFB 膠原蛋白合成量較A 組顯著下降 \\(P<0.05\\).其它組之間無統計學差異.
同一組不同時間點比較發現: C 組 3.4 kPa 氣體壓力作用10 h較5 h的HFB膠原蛋白合成量顯著下降\\(P <0.05\\),其它組之間無統計學差異.
六、 討 論
HFB是創傷修復過程中真皮的主要功能細胞,能合成細胞外基質的多種成分,而細胞外基質的過度沉積和降解不足可致創傷的過度愈合,形成病理性瘢痕\\(增生性瘢痕和瘢痕疙瘩\\).HFB的過度增生及分泌旺盛引起細胞外基質的過度沉積,直接導致增生性瘢痕的形成.只有盡量去除各種造成瘢痕增生的影響因素,增生性瘢痕才能及早得到治療[9~11].
壓應力在增生性瘢痕治療中起到了重要作用,體外研究壓應力對皮膚細胞和組織的影響,可以為在體環境下壓力在瘢痕基質代謝中的作用提供參考.臨床上多采用幾種方法相結合的方式治療增生性瘢痕,其中,采用手術療法徹底切除增生性瘢痕,再移植組織工程表皮薄片結合壓力法治療增生性瘢痕是常用的治療方法.臨床實踐證明,加壓的壓力一般為 3.4 kPa 左右,否則患者無法長期堅持,而臨床上對增生性瘢痕壓迫治療需要及早、持續、長期維持.但臨床上手術切除瘢痕后表皮移植及結合壓力治療增生性瘢痕的具體機制尚不明確.壓力可能是通過降低瘢痕組織附近血液供應,從而減少瘢痕組織中細胞的增殖,降低細胞外基質沉積;也可能是直接或間接抑制了細胞增殖和細胞外基質合成的信號通路,或促進了細胞外基質分解的信號通路[12].肖洪等[13] 研究認為,適當的持續壓應力對人增生性瘢痕成纖維細胞具有抑制增殖與促進凋亡的共同效應. HKC 的條件培養液釋放的因子在 HFB 細胞外基質基因表達中起調控作用[14~16],HKC分泌的多種細胞因子,如白介素\\(IL-1,IL-6,IL-8 等\\)、轉化生長因子 \\(TGF-β1 等\\)、腫瘤壞死因子、干擾素等[17~19],均可調控 HFB 的增殖及膠原蛋白的合成.其中,IL-1α 可明顯抑制 HFB 的膠原蛋白合成[20],TGF-β1 可以促進 HFB 的膠原蛋白合成[21] .
本課題組發現,無壓力培養的HKC分泌的膠原蛋白量低于無壓力培養的HFB分泌的膠原蛋白量,只有其1/10,且實驗中采用與國內外其他工作組相同的條件和方法保存 HKC 上清液:均離心后保存于4℃備用.
其他工作組在研究HKC上清液對HFB分泌的膠原蛋白含量的影響時,均忽略了HKC 上清液中膠原蛋白的含量,可能原因是于 4℃保存 HKC 上清液時,HKC 分泌的微量膠原蛋白存在降解的情況,故實驗中忽略了HKC分泌的膠原蛋白對HFB分泌的膠原蛋白含量的干擾作用.本實驗結果顯示:無力學刺激時,隨著時間的推移,HFB 數量及膠原蛋白的分泌量逐漸增多;有力學刺激時,隨著壓力加載時間的推移,HFB 數量增加減緩,膠原蛋白的分泌速度減慢,說明3.4 kPa 氣體壓力抑制了 HFB 增殖及膠原蛋白的合成;加入HKC 上清液促進了 HFB 增殖及膠原蛋白合成,即:兩種細胞的相互作用對傷口的愈合及再上皮化均有明顯的促進作用.3.4 kPa氣體壓力加載5 h對HFB增殖及膠原蛋白合成的抑制作用,與HKC上清液對HFB增殖及膠原蛋白合成的促進作用達到平衡;而3.4 kPa氣體壓力加載10 h對HFB增殖的抑制作用小于HKC上清液對HFB增殖的促進作用,對HFB膠原蛋白合成的抑制作用大于HKC上清液對HFB膠原蛋白合成的促進作用.
可以推測,正常的HKC上清液促進細胞增殖的作用早于3.4 kPa氣體壓力抑制細胞增殖的作用,而3.4 kPa氣體壓力抑制膠原蛋白合成的作用早于正常的HKC上清液促進膠原蛋白合成的作用,這與壓力抑制細胞增殖和膠原蛋白合成,以及上清液促進細胞增殖和膠原蛋白合成的信號通路不同有關.
厲孟等[22]推測 HKC 與 HFB 之間的調節可能是多種因子介導的,二者之間存在一個“HKC→各種HKC源活性因子\\(IL-1α、IL-1β等\\) →HFB→各種HFB源活性因子\\(IL-6、TGF等\\) →HKC”的環路,但其具體機制仍有待于研究.
為了使實驗結果更加可信,我們正在采用其它檢測手段,如 Western Blot、PCR 擴增等技術進行對比性實驗,以進一步說明 HFB 基因及膠原蛋白分類表達的情況.大量研究顯示壓力可以抑制 HFB 增殖及膠原蛋白合成,但仍不清楚力學信號的感受和響應機制及壓力抑制細胞增殖和膠原蛋白合成,與上清液促進細胞增殖及膠原蛋白合成的信號通路的不同之處,這些都將是我們下一步的研究重點.
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