脂蛋白\\(a\\)\\(Lp\\(a\\)\\)是心血管疾病的獨立危險因子，其由蛋白質和脂類物質兩部分組成，其中脂類物質與低密度脂蛋白\\(LDL\\)相似，主要為膽固醇，而蛋白質部分由apoB－100和apo\\(a\\)通過二硫鍵共價結合而成。apoB－100蛋白疏水性極強，部分被包埋于Lp\\(a\\)顆粒內部，分子量無明顯個體差異，而apo\\(a\\)基因具有多態性，且其表型具有地區種族差異性、受遺傳基因控制、每一個個體的基因型是終身固定的，不會因身體狀況而發生改變，因此apo\\(a\\)的基因型決定了Lp\\(a\\)的特性。研究發現，位于apo\\(a\\)基因啟動子區域上游信號序列存在一段五核苷酸重復序列\\(TTTTA\\)\\(pentanucleo－tiderepeat，PNＲ\\)。目前，對apo\\(a\\)PNＲ基因多態性與冠心病的關系，國內外研究結果并不一致。
本研究旨在探討apo\\(a\\)PNＲ基因多態性在蒙古族CHD病人中的分布情況及特點。
1 研究對象
研究對象來源于赤峰學院第一附屬醫院、赤峰市醫院冠脈造影明確診斷為CHD的三代直系親屬均為蒙古族的病人，共計71例，平均年齡為55．63±10．38歲。正常對照選自在校蒙古族學生、中心血站正常獻血蒙古族人員及醫院體檢未患動脈粥樣硬化、肝臟疾病、糖尿病及癌癥的的三代直系親屬也均為蒙古族的健康人群，共計66例，平均年齡30．20±6．87歲。
2 研究方法
2．1 血脂水平的測定
采集清晨空腹受檢者EDTA－Na2抗凝靜脈血4mL，及時分離血漿，密閉－20℃以下冰箱保存，五天內進行檢測。血漿Lp\\(a\\)測定使用免疫透射比濁法，用北京中生生物工程公司試劑盒。為確保測定結果可靠，每批標本測定均做標準曲線，同時做質控。血漿TG、TC測定選用酶學終點分析法。血漿HDL－C采用磷鎢酸－鎂沉淀法進行測定，血漿LDL－C采用聚乙烯硫酸鹽沉淀法進行測定。
2．2 PCＲ擴增
血細胞經過0.2%的氯化鈉低滲溶液破碎紅細胞后，用北京百泰克生物技術有限公司的細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。
引物設計參照BoHu等設計，由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成，序列為:5'－GAATTCATTTGCGGAAAGATTG－3'和5'－CT-TCAACCGGGGTGAGAGTCTC－3'。特異性擴增apo\\(a\\)5'端調控區信號密碼子上游1373bp處的\\(TTTTA\\)n五核苷酸串聯重復序列。
PCＲ擴增條件:94℃預變性90s，以下程序循環35次，94℃變性40s，60℃退火30s，72℃延伸40s，最后72℃再延伸5min，4℃保存。取產物2．5μL經3%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結果。
2．3 apo\\(a\\)PNＲ基因多態性的檢測
按照丙烯酰胺:N、N'－甲叉雙丙烯酰胺50∶2．5的比例配制10%的聚丙烯酰胺凝膠。150V預電泳30min，加樣1．5μL后再150V于4℃電泳10h。電泳結束后，凝膠首先在10%醋酸溶液中固定10min，蒸餾水沖洗1～2次后，于0．2%硝酸銀溶液中染色10min，水洗3～5次，再于含有0．4%甲醛的1．5%NaOH溶液中顯色，最后用0．75%的Na2CO3溶液終止。染色后的凝膠用quantityone軟件分析各條帶分子量。
2．4 DNA序列測定
挑選apo\\(a\\)\\(TTTTA\\)串聯重復序列數為5、8、9的各2個樣品用pGEM－T載體克隆，送至北京三博遠志生物技術有限責任公司測序。
2．5 統計學分析
數據以均數和標準差表示，apo\\(a\\)PNＲ等位基因和基因型頻率采用基因計數法計算，組間等位基因與基因型頻率比較采用χ2檢驗，組間血脂水平比較采用中位數計算的方法，組內不同基因型血脂水平比較通過方差齊性分析后，采用t檢驗，使用spss16．0軟件包進行統計學分析。
3 結果
3．1 血脂水平比較
CHD組與正常對照組各血脂水平見表1，其中CHD病人血漿TG、Lp\\(a\\)水平高于正常對照組，而血漿HDL－C水平低于正常對照組。
3．2 PCＲ擴增
產物的檢測apo\\(a\\)5'端調控區信號密碼子上游1373bp處的\\(TTTTA\\)n五核苷酸串聯重復序列PCＲ擴增產物經3%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。
3．3 等位基因與基因型頻率分布
兩組人群檢測出\\(TTTTA\\)重復次數為5、7、8、9共4種等位基因，對應PCＲ擴增產物的分子量分別為81bp、91bp、96bp、101bp，其中冠心病病人中檢測出重復次數為5、8、9共3種等位基因，兩組apo\\(a\\)PNＲ等位基因頻率見表2。
另外，兩組人群檢測出5/8、5/9、5/5、7/9、8/8、8/9、9/9共7種基因型，見圖2，兩組apo\\(a\\)PNＲ基因型頻率見表3，均無顯著性差異。
冠心病病人中apo\\(a\\)PNＲ中8/8與8/9基因型的平均血漿Lp\\(a\\)分別為204．58±115．15mg/L和170．60±93．84mg/L，通過t檢驗比對發現無顯著性差異，其它幾種基因型病例數太少，因此未進行統計分析。
4 討論
大量研究發現，高Lp\\(a\\)血癥是動脈粥樣硬化的獨立危險因子，其與纖溶酶原結構相似，可競爭性的抑制纖溶酶原轉化為纖溶酶。另外還發現，血漿Lp\\(a\\)水平的升高會促進血栓的形成，而血栓的形成有利于腫瘤細胞附著于血管，加速腫瘤細胞的轉移速度，且近年來研究發現，他汀類降血脂藥物可以抑制腫瘤細胞增殖。
本研究測定內蒙古地區蒙古族冠心病病人血漿Lp\\(a\\)平均水平為201．09±101．04顯著性高于正常對照組\\(P＜0．05\\)，但低于胡波等測定的湖北地區漢族動脈硬化性腦梗死病人的Lp\\(a\\)濃度239．9+225．4mg/L，BoHu等檢測的冠心病病人血漿Lp\\(a\\)濃度247+225mg/L，及劉曉寧測定的心肌梗死病人血漿Lp\\(a\\)的平均水平263mg/L。眾所周知，蒙古族人群的飲食習慣是以肉食和奶制品為主，而這些數值的差異，進一步說明血漿Lp\\(a\\)濃度具有地區、種族的差異，且幾乎不受飲食及生活方式的影響。
本次研究發現，內蒙古地區蒙古族人群共存在4種apo\\(a\\)5'端PNＲ等位基因和7種基因型，分別為重復次數5、7、8、9和5/8、5/9、5/5、7/9、8/8、8/9、9/9，明顯少于MarionT等人發現的黑種人、歐美白種人、胡波等發現的湖北地區漢族人群及梁紅艷等人發現的哈爾濱地區人群的等位基因和基因型的種類，但是序列重復數為8的等位基因及基因型8/8頻率均最高。Apo\\(a\\)等位基因及基因型的分布與地區、種族的差異有關，而蒙古族是個古老民族，人口遷移率不高，且我們選取的研究對象為3代直系親屬均為蒙古族有關;也可能是因為那些基因型分布頻率太低，未能被發現。
本次研究發現冠心病病人血漿Lp\\(a\\)濃度明顯高于正常對照組，而apo\\(a\\)5'端PNＲ各等位基因及基因型頻率與正常對照組比較無顯著性差距。
目前，已經研究發現血漿Lp\\(a\\)水平主要受遺傳因素影響，且與apo\\(a\\)大小呈反比例關系那么apo\\(a\\)的PNＲ究竟起到什么調控作用呢?目前，我們認為其對apo\\(a\\)表達的調控是與其它調控位點協調作用的結果，那么，它究竟是與哪些位點共同作用其作用呢，Kringle重復序列，一些單核苷酸多態性位點，還是apoE的基因多態性呢?接下來我們準備利用ＲNAi技術對apo\\(a\\)5'端的多態性位點進行干擾，以了解其對apo\\(a\\)的大小、表達量和Lp\\(a\\)合成的影響。
本次研究共發現了4種等位基因，但是冠心病病人各等位基因及基因型頻率與正常對照組比較無顯著性差距，這與胡波等及劉曉寧對對漢族冠心病病人研究發現的等位基因\\(TTTTA\\)5及基因型\\(TTTTA\\)5/8頻率明顯高于正常對照組有所不同。因此，apo\\(a\\)等位基因\\(TTTTA\\)5可能是我國漢族人群冠心病發生的一個危險因素，但對于內蒙古地區蒙古族冠心病病人來說apo\\(a\\)5'端PNＲ基因多態性與冠心病的發生未發現直接相關性，但是不排除其與其它調控位點協同作用對冠心病的發生發展具有影響。
