不育不孕癥嚴重影響到一個家庭的和睦及幸福，隨著科技及化工業的發展，不育不孕癥患者越來越多，成為本世紀嚴重危害人類生殖健康的疾病之一。

據世界衛生組織（WHO）統計，全世界育齡夫婦中大約有15%存在生育問題（WHO1987年），這部分人群中有50%不育與男性因素有關，而由遺傳缺陷因素所引起的生精障礙約占男性不育因素的30%。男性不育患者中Y染色體長臂無精子癥因子（azoos-permiafactor，AZF）區微缺失被認為是最重要的非梗阻性無精及少精癥因素之一，現代分子生物學和細胞遺傳學的研究亦證實了與精子生成相關的AZF基因存在于Y染色體長臂q11區，目前將Y染色體AZF區分為4個區位，分別為：AZFa區、AZFb區、AZFc區和AZFd區，其中任何一個區域座位點的微缺失都可導致生精障礙，造成少精或無精而導致男性不育，其微缺失引起的男性不育發生率僅次于Klinefelter綜合征，并且在進行輔助生殖技術卵胞質內單精子注射（ICSI）過程中能將這種遺傳缺陷傳遞給男性下一代，因此在進行ICSI治療之前進行Y染色體微缺失檢測具有重要的臨床及理論意義。

本研究對來我院診治的332例男性精子異?；颊呒?00名已育男性進行外周血Y染色體AZF微缺失基因檢測，現總結分析報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

病例組：選擇2011年7月至2014年1月到我院生殖中心診治的不育男性患者（年齡20～46歲），診斷標準：女方檢查正常，結婚1年以上，未采取避孕措施且夫妻生活正常的情況下不能生育的非阻塞性男性患者，在排除了其他原因如感染等原因后對其進行精液常規分析，按照WHO精液分析標準分類：精子密度<20×106/mL者為少精癥患者；患者每間隔7~14d留取精液檢測1次，連續3次未發現精子，進一步離心沉淀也沒有發現精子者為無精癥患者。對精液分析為異常的患者進行Y染色體AZF微缺失基因檢測；陰性對照：健康女性作為陰性對照；健康對照組：100名精子密度>20×106/mL的已婚男性（年齡20～46歲）為健康對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 研究對象的DNA抽提：用含乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）抗凝劑的真空管抽取受試者外周血2mL并充分混勻。提取白細胞DNA的試劑盒為深圳亞能生物技術有限公司提供的全血DNA快速提取試劑盒。

1.2.2 多重聚合酶鏈反應（PCR）擴增檢測：用深圳亞能生物技術有限公司提供的Y染色體微缺失檢測試劑盒，同時檢測Y染色體AZF區域內的以下15個STS序列標鑒位點（sequencetagsite，STS），包括AZFa區：SY82，SY84，SY86；AZFb區：SY124，SY127，SY143，SY134，SY128，SY133；AZFc區：SY254，SY255，SY242，SY239；AZFd區：SY152，SY145。15個序列標鑒位點分成紫、白、藍、黃4管擴增，詳細每管檢測位點及排列位置見表1。每管包括14μLPCR反應液，10μL去離子水，1μL待測樣本DNA，總體積共25μL。



設定的擴增程序分為3個步驟：第1個為步驟為50℃10min，95℃15min；第2個為步驟為94℃30s，58℃60s，72℃60s共34個循環；第3個步驟為72℃10min。內控對照為Y染色體性別決定區SRY基因，每次實驗均以已育健康男性基因組DNA作為陽性對照，健康女性基因組DNA作為陰性對照。

1.2.3 電泳檢測：吸取PCR擴增后產物6μL。點樣于事先配制好的2%Biowest進口瓊脂糖凝膠孔中，先用電壓8V/cm，電泳4~5min使DNA遷移出上樣孔，再將電壓調降到5V/cm電泳30~40min，取出瓊脂糖凝膠在凝膠成像系統觀察電泳結果。

1.2.4 結果判讀：Ⅰ管，Ⅱ管，Ⅲ管，Ⅳ管分別為健康男性的DNA提取物分別加入紫、白、藍、黃4管，Y染色體微缺失檢測正常（見圖1）PCR電泳對照結果顯示，檢測者AZFc+AZFd區缺失，缺失位點分別是SY152、SY239、SY242、SY254、SY255（見圖2）。



1.3 統計學處理

計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Y染色體微缺失檢測結果：經多重PCR擴增后電泳結果，100名健康對照組男性組未見Y染色體AZF區微缺失，健康女性對照組未見電泳區帶。332例不育男性患者中共檢出28例Y染色體AZF區微缺失，AZF微缺失率為8.4%。

180例少精子癥患者中檢出16例Y染色體AZF區微缺失，AZF微缺失率為8.9%。152例無精子癥患者中檢出12例Y染色體AZF區微缺失，AZF微缺失率為7.9%；無精子癥患者和嚴重少精子癥患者的Y染色體AZF區微缺失率差異無統計學意義（P>0.05）。100名已育健康男性組與不育男性組Y染色體AZF微缺失（8.4%）比較差異有統計學意義（P<0.01）。

男性不育癥患者Y染色體微缺失情況：AZFb區3例，占10.7%；AZFc區15例，占53.6%；AZFa+AZFc區3例，占10.7%；AZFb+AZFc區4例，占14.3%；AZFc+AZFd區2例，占7.1%；AZFb+AZFc+AZFd區1例，占3.6%。最常見的AZF微缺失區域位于AZFc，其次是AZFb+AZFc，最后依次分別是AZFa+AZFc，AZFb，AZFc+AZFd，AZFb+AZFc+AZFd，并且，AZFc區的缺失率明顯高于AZFb區（P<0.05）。

3 討論

近年來研究表明男性不育的遺傳學病因主要包括Y染色體微缺失及基因突變、單核苷酸多態性、染色體畸變等，其中以Klinefelter綜合征、囊性纖維化及Y染色體微缺失最為常見，由Y染色體微缺失引起的男性患者無精子和嚴重少精子受到越來越多的重視。由Y染色體微缺失引起的精子生成障礙，采用藥物治療通常無效。因此對不育男性患者進行Y染色體微缺失篩查，對臨床診斷不育和選擇治療方案具有重要意義。實施ICSI是目前臨床對無精子癥和嚴重少精子癥男性不育者較為有效的治療方案，有Y染色體微缺失的精子，其胚胎種植率與正常精子并無差別，但能將Y染色體微缺失基因遺傳給下一代男性，引發與上一代相同的癥狀，為避免Y染色體微缺失基因傳至下一代，可選擇女性胚胎。

另外有資料顯示，AZFa或AZFb完全缺失者，通過睪丸穿刺獲得精子的可能性幾乎為0，基本沒有必要進行睪丸穿刺術獲取精子，因此為了提高穿刺取精的成功率有必要在術前進行Y染色體微缺失的檢測。AZFc缺失患者通過睪丸精子穿刺獲得精子的概率比其他缺失類型大，同時可以從睪丸穿刺獲得精子進行單精子卵泡質內注射助孕，但這些患者的后一代男性也都將是AZFc缺失的攜帶者，通過胚胎植入前進行Y染色體微缺失檢測，選擇女性胚胎可避免傳到下一代。

本次研究對不育男性患者中180例重度少精子癥和152例非阻塞性無精子癥患者進行Y染色體微缺失進行篩查，發現有28例存在Y染色體微缺失，發生率為8.4%。包括AZFb、AZFc、AZFa+AZFc、AZFc+AZFd、AZFb+AZFc+AZFd區等多種缺失類型，在各種缺失類型中，以AZFc缺失最為常見，嚴重少精癥和無精癥患者AZF缺失的發生率相近。研究發現，Y染色體AZF微缺失對精子的生成有重要的影響，除AZFc缺失患者可能存在精子生成能力外，其他類型的缺失均發現無精子生成能力，為無精子癥患者。同時AZFc缺失患者精子有進行性數量下降的趨勢，部分患者最后發展為無精癥，因此如果診斷為AZFc缺失的患者，應及早進行精液凍存，為以后助孕作準備。

本研究表明Y染色體微缺失是男性原發不育癥的重要遺傳病因。Y染色體微缺失檢測對于指導臨床診斷和選擇治療方案，減少遺傳病的發生等都具有重要意義；故精子異常的不育患者，在確定治療方案前，都應常規進行Y染色體微缺失檢查。