特發性肺纖維化\\( idiopathic pulmonary fibrosis，IPF\\) 病因未明、好發于成人、局限于肺部、進行性進展，以尋常型間質性肺炎為病理特征的一種間質性肺疾病。IPF 確診后的平均生存時間僅僅 2． 8 ～4． 2 年。由于其發病機制和病因未明，診斷困難，缺乏有效的治療和較差的預后，因此，積極探討 IPF的病因或發病機制，進而尋找有效的治療手段成為目前學術界研究的重要方向。最新研究表明，白細胞介素 17A\\( interleukin 17A，IL-17A\\) 作為一種促炎癥細胞因子，參與了慢性炎癥過程和自身免疫性疾病。Su 等的研究提示，IL-17A 信號通路中的組分有望成為治療肺纖維化的新的潛在分子治療靶點。
本實驗旨在探討 IL-17A 在肺纖維化發病機制中的作用，進而為后續探索分子靶向藥物治療 IPF 的新途徑奠定堅實的基礎。
1 材料和方法
1． 1 材料 清潔級雌性 Wistar 大鼠 20 只，體質量 180 ～ 200 g，購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司; 戊巴比妥鈉為江蘇恒瑞醫藥股份有限公司產品; 博來霉素 A5 為哈爾濱萊博通藥業有限公司產品; 兔抗 IL-17 免疫組化試劑盒為北京博奧森生物技術有限公司; IL-17A ELISA 試劑盒為 Bio-Ｒad 公司產品; 總 ＲNA 提取試劑盒為天根生化科技有限公司產品;改良型 ＲPMI1640 培養基、1 × 高糖 DMEM 培養基、胎牛血清為 HyClone 公司產品; 引物為上海生工生物工程有限公司產品; ＲNA 逆轉錄試劑盒、PCＲ 試劑盒為成都博瑞克生物技術有限公司產品。
1． 2 方法
1． 2． 1 肺纖維化動物模型的建立 20 只雌性 Wistar 大鼠隨機平均分成對照組即生理鹽水\\( normal saline，NS\\) 組和模型組即博來霉素\\( bleomycin，BLM\\) 組。參照文獻［4］的方法進行造模: BLM 組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉\\( 40 mg/kg 體質量\\)進行麻醉，在無菌操作下，鈍性分離暴露氣管，向 BLM 組大鼠氣管注入含 BLM A5\\( 5 mg/kg 體質量\\) 的 NS 0． 3 mL，迅速將大鼠直立并旋轉，使藥液在肺內分布均勻。同條件下以相同的方法將同體積 NS 注入 NS 組大鼠氣管。
1． 2． 2 肺組織的留取和病理分析 兩組實驗動物均于氣管內灌注 NS 或 BLM 后 7 d 和 28 d 通過右心室采血各處死一半。參照文獻［5］的方法得到肺組織和支氣管肺泡灌洗液\\( bronchoalveolar lavage fluid，BALF\\) 。左肺注入 40 g/L 的多聚甲醛，并置于 40 g/L 多聚甲醛中固定。取 3 塊不同部位的肺組織，石蠟包埋后做成切片，厚度為 5 μm，切片使用 HE和 Masson 染色來評價其病理改變\\( 肺泡炎和肺纖維化\\) ，具體標準主要參考文獻［6 －7］中的方法來確定。
1． 2． 3 肺組織 IL-17 的免疫組化染色 肺組織切片脫蠟、水化、修復抗原、血清封閉; 一抗為兔抗 IL-17 單克隆抗體\\( mAb\\) 1∶100，二抗為 HＲP 標記的山羊抗兔抗體，DAB 顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片。對照組用 PBS 代替一抗。
利用 Leica 系統對免疫組化染色結果進行圖像采集，再利用ImagePro plus 6． 0 軟件對其進行分析，隨機選取 2 個時間點肺組織切片染色區域 5 個高倍視野，計算陽性染色的平均吸光度\\( A\\) 值。
1． 2． 4 BALF 細胞計數與分類 參照文獻［8］的方法作細胞數測定，行支氣管肺泡灌洗收集 BALF 后取 10 μL 細胞懸液充入細胞計數板，用低倍鏡計數四角的四個大方格中的細胞數。沉淀細胞涂片，瑞氏染色后行細胞分類，選取 100 個白細胞，按其形態特點進行分類計數，求出各種白細胞所占的百分率，再以細胞總數求得 BALF 中各類白細胞的絕對值。計算公式: 細胞數/L = N/4 ×10 C ×106，其中 N 為 4 個大方格內的白細胞總數，C 為稀釋倍數。
1． 2． 5 ELISA 檢測 BALF 中 IL-17A 的含量 使用 ELISA 試劑盒對 BALF 中 IL-17A 的濃度進行檢測，具體檢測步驟按照試劑盒的說明書操作。
1． 2． 6 肺泡巨噬細胞的分離、純化、培養 行右肺支氣管肺泡灌洗收集 BALF，將細胞懸液用含 100 mL/L 小牛血清的ＲPMI1640 培養液在培養瓶中經 37℃ 、50 mL / L CO2的細胞培養箱內孵育純化 3 h，棄培養液，將貼壁純化的肺泡巨噬細胞\\( alveolar macrophage，AM\\) 再分別用 DMEM 進行培養。兩組AM 均采用 6 孔板進行培養，每組 6 個復孔，每孔細胞數為5 × 105，培養12、24、48 h 后各收集其細胞和培養上清液，備用\\( 上清液用作 IL-17A 的檢測，細胞用作 IL-17A mＲNA 的檢測\\) 。
1． 2． 7 反轉錄 PCＲ 檢測 AM 中 IL-17A mＲNA 的表達 從PubMed 數據庫中獲取大鼠 IL-17A mＲNA 全序列，IL-17A 引物由上海生工生物工程公司設計和合成，甘油醛-3-磷酸脫氫酶\\( GAPDH\\) 作 為 內 參 照。IL-17A \\( 188 bp\\) ，上 游 引 物:
5'-CTA CCTCAACCGTTCCACT-3'， 下 游 引 物: 5'-TTCTCAG-GCTCCCTCTTC-3'; GAPDH \\( 450 bp\\) ，上游引物: 5'-ACCA-CAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物: 5'-TCCACCACCCTGTT-GCTGTA-3'。采用 TＲIzol 試劑盒提取 AM 總 ＲNA，逆轉錄反應合成 cDNA，反轉錄 PCＲ 反應嚴格按照試劑盒說明書進行，所有樣本與 GAPDH 的比值作為 IL-17A mＲNA 相對表達量。
1． 2． 8 統計學分析 采用 SPSS13． 0 軟件完成。結果以 x ± s表示，采用單因素方差分析和 q 檢驗，所有的比較中，P ＜ 0． 05表示差異有統計學意義。
2 結果
2． 1 兩組大鼠肺組織的病理變化 模型組第 7 天時肺泡腔、肺間質內均可見較多炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增寬，肺間質可見少量膠原纖維組織; 第 28 天時肺泡腔內滲出較少，肺泡結構被破壞，其間隔增寬顯著，細胞外基質增生明顯，肺間質大量的成纖維細胞也明顯增生，大量膠原纖維沉積，形成廣泛的纖維化。與NS 組相比，BLM 組第 7 天時肺泡炎較明顯，第 28 天時肺泡炎減輕，而肺纖維化程度較重\\( 圖1，表1\\) .2． 2 免疫組化檢測肺組織 IL-17A 蛋白的表達 NS組大鼠肺組織中IL-17A 呈弱表達，第7 天、28 天表達量無明顯變化，分別為 23． 67 ± 3． 19，24． 26 ± 3． 35，而BLM 組第 7 天、28 天 IL-17A 表達明顯增強，分別為103． 48 ± 9． 49，87． 42 ± 7． 64，較 NS 組明顯增加，差異有統計學意義\\( P ＜ 0． 05\\) ，而第 28 天表達較第7 天有所降低\\( 圖 2\\) 。2． 3 BALF 中細胞數及細胞類型分析 第 7 天，NS組 BALF 中細胞總數為\\( 9． 45 ± 0． 76\\) 個，BLM 組BALF 細胞總數為\\( 35． 28 ± 2． 76\\) 個; 與 NS 組比較，BLM 組 BALF 細胞總數明顯增高，差異有統計學意義\\( P ＜ 0． 05\\) ，第 28 天 NS 組中 BALF 細胞總數為\\( 9． 52 ±0． 67\\) 個，BLM 組為\\( 9． 71 ± 0． 80\\) 個，兩者差異無統計學意義\\( P ＞ 0． 05\\) ; 與 NS 組比較，第7 天，BLM 組 BALF 中 AM 比例較小，中性粒細胞和淋巴細胞百分比均明顯增加，差異有統計學意義\\( P ＜0． 05\\) ; 第 28 天，BLM 組 BALF 細胞分類百分比，與 NS 組相比無顯著性差異\\( P ＞0． 05，表2\\) ，表明細胞類型基本恢復正常。2． 4 BALF 中 IL-17A 的測定 第 7 天、28 天，NS組 BALF 中 IL-17A 分別為\\( 57． 45 ± 6． 68\\) pg/mL、\\( 55．49 ±6．06\\) pg/mL，BLM 組第 7 天、28 天 IL-17A含量高達\\( 278．37 ±13． 99\\) pg/mL 和\\( 213． 26 ±11． 62\\)pg / mL，與 NS 組相比，均明顯增高，差異有顯著統計學意義\\( P ＜0． 01\\) ，但第 28 天時 IL-17A 含量較第7 天略有降低，但差異無統計學意義。
2． 5 AM 培養不同時期上清液中 IL-17A 的濃度變化 BLM 7 d、28 d 組 AM 培養前12 h、24 h、48 h 上清液中 IL-17A 的濃度與 NS 組比較，均明顯增高，差異有統計學意義\\( P ＜0． 05，表 3\\) 。2． 6 AM 中 IL-17A mＲNA 的表達 BLM 7 d 組、28 d 組各時期 AM 中 IL-17A mＲNA 的表達明顯高于NS 組，差異有統計學意義\\( 圖 3、4，P ＜ 0． 05\\) ; 尤以前 12 h 顯著，24 h、48 h 表達逐漸減弱\\( 圖 5\\) 。
3 討論
目前普遍認為 IPF 的發病機制可能是炎癥導致肺泡上皮細胞損傷后，上皮細胞異常增生和再上皮化異 常 修 復 最 終 引 起 肺 纖 維 化。白 介 素 17A\\( IL-17A\\) 作為一種重要的促炎癥細胞因子，其過度表達容易導致慢性炎癥和自身免疫性疾病，而抗IL-17A抗體和抗 IL-17AＲ 抗體通過阻斷 IL-17A 或IL-17AＲ 則在強直性脊柱炎、銀屑病等多種免疫性疾病中顯示出一定的療效?？?IL-17A 抗體能否在治療 IPF 中發揮作用呢? 在本實驗中，我們研究了肺纖維化大鼠肺組織炎癥情況下 IL-17A 的表達，結果表明，在肺纖維化的發生和發展中，肺組織表達IL-17A 和 AM 分泌 IL-17A 均增加，在肺泡炎階段更為明顯，提示 IL-17A 可能促進了肺泡炎的形成，進而參與了肺纖維化形成。該結果為后續研究靶向治療 IPF 提供了依據。
IL-17A 是 IL-17 家族中重要成員，是重要的促炎癥因子。IL-17A 在抵抗某些病原體的入侵以及誘導和維持慢性炎癥的過程中發揮了重要的作用。Wilson等研究認為，BLM 誘導的肺纖維化是由 IL-17A 所介導的，而 IL-17A 的致肺纖維化作用則依賴于 TGF-β，在氣道內大劑量地注射 IL-17A 可以誘導肺纖維化的發生?？梢?IL-17A 和其他細胞因子可協同作用于肺纖維化的發生發展。Gasse 等同樣發現，BLM 所導致的肺損傷早期 IL-17A 表達增加，并通過基因缺陷小鼠和中和抗體處理小鼠證實 BLM 誘導的早期肺泡炎癥需要 IL-17A 和 IL-17A 信號轉導通路參與。中和 IL-17A 活性可以改善肺纖維化小鼠肺功能。本實驗結果顯示，與 NS 組相比，BLM組第 7 天 BALF 細胞總數明顯增多，AM 比例明顯降低，中性粒細胞及淋巴細胞比例均明顯增高; BLM組第 7 天、第 28 天 BALF 和肺組織中 IL-17A 的表達明顯升高; 說明 IL-17A 作為炎癥細胞因子對中性粒細胞等炎癥細胞有較強的趨化聚集作用，參與了肺泡炎和肺纖維化的進程，并且可能起著極為重要的作用。這與其他人的研究結果相互驗證。
AM 異?；罨梢砸鸺毎蜃赢惓１磉_，從而在調節肺部炎癥方面有其重要作用，并通過多種途徑影響肺纖維化的發展進程。本實驗應用 ELISA檢測 AM 不同培養時期上清液中 IL-17A 的濃度變化，研究結果顯示，與 NS 組相比，BLM 組大鼠 7 d、28 d AM 培養上清液中 IL-17A 的表達量明顯升高，以前 24 h、48 h 更為明顯，證實 AM 分泌了 IL-17A，而且經誘導刺激后會大量分泌，從而參與了肺纖維化的形成。大鼠 BLM 7 d 組 AM 培養上清液中 IL-17A 的表達量較 28 d 組高，同時也說明 IL-17A 在肺纖維化的形成和演變中可能起重要作用，在肺泡炎階段發揮的作用比肺纖維化階段可能更大。應用ＲT-PCＲ 檢測 AM IL-17A mＲNA 的表達，其結果顯示，與 NS 組相比，BLM 7 d 組、28 d 組培養各時期的表達明顯增高，尤以前12 h 顯著，24 h、48 h 表達逐漸減弱，說明由于 AM 的體外培養沒有了誘導劑的繼續參與，其 IL-17A mＲNA 的表達逐漸減弱，更進一步證實了 AM 分泌 IL-17A，經誘導刺激后會大量分泌參與形成肺纖維化。同樣也可以看出大鼠BLM 7 d 組 AM 培養 IL-17A mＲNA 表達量較 28 d 組高，再次說明 IL-17A 在肺纖維化的發生、發展的病理過程中可能起重要作用，在肺泡炎階段發揮的作用可能更大，而中和 IL-17A 則有可能治療 IPF。
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