缺血再灌注損傷的概念于１９６０年由Ｊｅｎｎｉｎｇｓ提出，其機制較為復雜，除與氧自由基、鈣超載、能量代謝障礙等有關外，近年認為與細胞凋亡也有著密切關系。細胞凋亡是生理性或某些因素誘發的程序化細胞死亡，但其細胞信號傳導通路并不完全明了。近年研究表明分裂原激活蛋白激酶家 族（ＭＡＰＫ）是一條重要通路，關于其超家族成員ｐ３８ＭＡＰＫ在其中所起作用的研究較少。本研究通過 建 立 缺 血 再 灌 注 損 傷 細 胞 模 型，探 討ｐ３８ＭＡＰＫ在心肌細胞缺血再灌注損傷中的作用。
１材料與方法
１．１主要試劑與儀器
凱基ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ細胞凋亡檢測試劑盒，ｐ３８ＭＡＰＫ抑制劑（購自Ｓｉｇｍａ公司，ＳＢ２０３５８０），胰蛋白 酶 （Ｇｉｂｃｏ，美 國），新生牛血清 （Ｇｉｂｃｏ，美國），ＤＭＥＭ培養基（高糖）（Ｇｉｂｃｏ，美國），５－溴脫氧尿嘧啶（Ｓｉｇｍａ，美國），Ⅱ型膠原酶（Ｓｉｇｍａ，美國），α－橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體（ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃａｃｔｉｎ，α－ＳＡ），ＳＡＢＣ免疫組織化學試劑盒，ＤＡＢ顯色試劑盒（購自北京博奧森公司，內含ＤＡＢ染色試劑盒、２５ｘＡ顯 色 液、２５ｘＢ顯 色 液）。熒 光 倒 置 顯 微 鏡（ＣａｒｌＺＥＩＳＳ）、顯微鏡（ＣａｒｌＺＥＩＳＳ）、倒置顯微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳＴＯＫＹＯ），流式細胞儀（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲＥＰＩＣＳＡｌｔｒａ）。
１．２細胞培養及鑒定
選?。薄玻潺gＳＤ乳鼠，在無菌條件下開胸取心臟，將心肌組織放于含有ＤＭＥＭ液的３０ｍｍ培養皿中，用眼科剪刀將心室剪成１ｍｍ３的組織碎塊，加入５倍體積的０．０６％胰蛋白酶溶液，混勻后置３７℃恒溫箱消化１０ｍｉｎ，靜置后吸出上清液，于５０ｍｌ離心管中用２倍體積含１０％新牛血清的ＤＭＥＭ培養液終止消化。重復上述過程６～８次。
將各次消化產物以１０００×ｇ離心１０ｍｉｎ，棄上清后將細胞重懸于１０％ Ｇｉｂｃｏ血清培養液中，接種于１００ｍｍ培養皿，在３７℃恒溫箱中培養孵育１ｈ，輕輕吸出細胞懸液后，以１０５／ｍｌ的密度分別接種于兩個６０ｍｍ培養皿，并置３７℃、５％ＣＯ２恒溫箱中培養。
１２ｈ左右更換培養液。用小鼠抗大鼠心肌特異性ＭＨＣａ／Ｉ３、ＴｎＩ抗體（按１∶１００和１∶５０分別稀釋）于４℃孵育過夜。然后分別用ＦＩＴＣ標記的山羊抗小鼠ＩｇＧ及羅丹明標記的山羊抗小鼠ＩｇＧ抗體孵育１ｈ。隨機選?。保皞€視野在熒光顯微鏡下觀察，免疫熒光染色為黃色的細胞為心肌細胞，計數并攝像。
１．３分組及模型建立
取原代培養第３天的心肌細胞按１×１０５的密度種植于２５ｍｍ培養瓶中，將培養成功的心肌細胞隨機分成缺血組（Ａ組）、缺血再灌注組（Ｂ組）、Ｐ３８ＭＡＰＫ拮抗劑干預組（Ｃ組）和空白對照組（Ｎ組）。
Ａ組：將模擬缺血液在氮氣中飽和１ｈ后，吸出培養液加入模擬缺血液，通入１００％氮氣１０ｍｉｎ后馬上封閉瓶口，放入恒溫箱中培育２４ｈ；Ｂ組：將模擬再灌注液在氧氣中飽和１ｈ后，把缺血２４ｈ的細胞培養瓶中的模擬缺血液吸出，加入經９５％ Ｏ２和５％ ＣＯ２的混合氣體飽和１ｈ的模擬再灌注液，并通入９５％ Ｏ２和５％ ＣＯ２的混合氣體１０ｍｉｎ后迅速封閉瓶口，放入恒溫箱中培育１ｈ；Ｃ組：加入ｐ３８ＭＡＰＫ抑制劑ＳＢ２０３５８０（５ｍｍｏｌ／Ｌ），３７℃預孵育１０ｍｉｎ后，按照Ｂ組程序操作。
１．４流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率
將４組心肌細胞用首先用Ｄ－ｈａｎｋｐｓ液清洗１遍，然后加入０．１２５％的胰蛋白酶，將心肌細胞消化下來立即送到流式細胞儀室做流式分析。散點圖左上象限顯示死亡細胞，左下象限顯示活細胞，右上象限顯示死亡細胞及后期凋亡細胞，右下象限顯示早期凋亡細胞。
１．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法檢測
ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表達用蛋白裂解液提取轉染后ＡｎｇⅡ刺激的細胞蛋白，用１５％聚丙酰胺凝膠電泳，１００Ｖ電泳至溴酚藍達到凝膠的底部，３０Ｖ過夜電轉移至硝酸纖維膜上，含５％脫脂奶粉封閉液封閉２ｈ，加入１∶１０００鼠抗單克隆抗體，４℃孵育過夜，辣根過氧化物連接的二抗室溫孵育２ｈ，加入ＢＣＩＰ／ＮＢＴ顯色。用ＧＤＳ８０００凝膠成像系統進行圖像分析。
１．６統計學處理
采用ＳＰＳＳ１７．０統計軟件統計數據，計量資料以珚ｘ±ｓ表示，兩組間比較使用ｔ檢驗比較。多組比較應用單因素多組方差分析（ＡＮＯＶＡ），組間采用ｑ檢驗。
２結果
２．１各組心肌細胞凋亡的測定結果
各組心肌細胞凋亡率見表１，細胞流式圖見圖１。
２．２心肌細胞各組
ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表達各組心肌細胞ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表達見表２和圖２。
２．３細胞凋亡與ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表達的相關性相關性分析顯示，細胞凋亡與ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表達呈正相關（ｒ＝０．９１８，Ｐ＜０．０１）。３討論
已有研究表明，凋亡是細胞在缺血再灌注損傷過程中的重要死亡形式。細胞在缺血再灌注時激活大量細胞因子，進而激活信號通路，調控細胞的凋亡，但其細胞內的信號轉導途徑目前仍不十分清楚。ｐ３８ＭＡＰＫ的激活是心肌缺血再灌注損傷中信號轉導的一個重要環節，ｐ３８ＭＡＰＫ信號通路被激活后可磷酸化熱激蛋白２７（ＨＳＰ２７）、ＭＡＰＫ干擾激 酶１（ＭＮＫ１）與ＭＮＫ２、細 胞 質 磷 脂 酶Ａ２（ｃＰＬＡ２）等底物，同時向細胞核內傳遞信號，磷酸化和激活多種蛋白激酶和轉錄因子，如絲裂原和應激激活的蛋白激酶１（ＭＳＫ１）、血管內皮細胞生長因子（ＶＥＧＦ）等。調控ＤＮＡ的轉錄，進而發揮增殖、分化、凋亡等，最終表現為加重損傷和延緩損傷兩種不同的生物學效應。目前，ｐ３８ＭＡＰＫ在凋亡中的作用仍有爭論。有研究報道在心肌缺血再灌注后ｐ３８ＭＡＰＫ可以大量激活Ｈｓｐ２７，促進細胞應激時紊亂的肌動蛋白修復，使細胞構型保持完整，從而對心肌細胞產生保護作用。但也有研究證實，ｐ３８ＭＡＰＫ在缺血后可以調節ＭＡＰＫ激活蛋白激酶－２、ｃａｓｐａｓｅ－１、ｃａｓｐａｓ－３及ｃａｓｐａｓｅ－１１的激活和ＴＮＦ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６的生成，從而介導凋亡并引起心肌功能的減退。Ｋａｓｉｅｒ等研究發現，ｐ３８ＭＡＰＫ的激活或ｐ３８ＭＡＰＫ基因的過度表達均使缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡明顯增加，心功能降低。各實驗結論之所以存在差異，可能與ｐ３８ＭＡＰＫ激活后作用于不同的底物，這些促凋亡底物及抑制凋亡底物不平衡有關，也有可能為動物離體研究及人為敲除或增加ｐ３８ＭＡＰＫ基因與在體研究存在差異有關。
本研究表明，心肌細胞在缺血再灌注過程中，ｐ３８ＭＡＰＫ被大量活化為ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ，單純缺血組和對照組僅有少量活化，使用ｐ３８ＭＡＰＫ抑制劑后ｐ３８ＭＡＰＫ的活化顯著減少，差異顯著。提示缺血再灌注過程可使ｐ３８ＭＡＰＫ磷酸化為具有生物學活性的ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ。研究顯示，缺血組較對照組細胞凋亡率未見明顯差異，而缺血再灌注組和對照組相比，凋亡率明顯升高，這表明在心肌細胞缺血期，細胞凋亡不是細胞死亡的主要形式，凋亡主要發生在再灌注過程中。使用ｐ３８ＭＡＰＫ抑制劑ＳＢ２０３５８０后，缺血再灌注過程凋亡率明顯下降，說明ｐ３８ＭＡＰＫ的活化促進了細胞的凋亡，是心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡的重要信號途徑。但使用ｐ３８ＭＡＰＫ后抑制劑組的細胞凋亡率仍高于缺血組，表明除了ｐ３８ＭＡＰＫ信號通路調控細胞凋亡過程外，還有其他信號通路參與心肌細胞的凋亡。這與我們動物實驗的結果相一致。
心肌缺血再灌注損傷的機制較復雜，ｐ３８ＭＡＰＫ僅為其中信號轉導途徑之一。目前ｐ３８ＭＡＰＫ各級聯反應的功能及生物學特性尚不明確，級聯反應的上下游激酶及作用的底物亦不十分清楚。但隨著實驗平臺的搭建及技術的深入，相信ｐ３８ＭＡＰＫ信號途徑在心肌缺血再灌注損傷中的機制會越來越清晰。而在信號傳導途徑水平進行藥物干預，也將為防治心肌再灌注損傷提供有利手段，同時也為缺血性心臟疾病的基因治療提供新的線索和思路。
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