慢性缺氧時出現局部肺血管收縮，通氣不足的肺組織區域內動脈收縮、血流減少，肺通氣相對充足的肺組織血流增加，從而提高氧利用率，有助于維持血氧濃度。持續的肺血管收縮將導致肺動脈高壓、右心功能不全。目前對肺動脈高壓尚無有效的治療藥物，深入研究肺血管收縮機制有益于提高對該病的防治水平。慢性缺氧性肺血管收縮與多種因素有關，如細胞色素P450、白三烯等，但肺血管收縮的分子機制尚未完全闡明。有報道缺氧可誘導肺小動脈15－脂氧化酶的表達，使其產物15-羥廿碳四烯酸\\(15-hydroxyeicosatetraenoic acid，15-HETE\\)生成增加，15-HETE很有可能作為缺氧所誘導的初始因子參與肺血管收縮。由于15-HETE在體內不穩定，極易被氧化，通過對其代謝終產物的比較研究，發現15-酮基二十碳四烯酸\\(15-ketoeicosatetraenoic acid，15-KETE\\)具有更強收縮肺血管的作用，因此，15-KETE可能是缺氧誘導肺血管收縮中的重要參與因子。目前尚未見15-KETE引起肺血管收縮的信號轉導途徑的研究報道。本研究擬探討15-KETE對缺氧大鼠肺動脈環的收縮是否與細胞外調節蛋白激酶1/2\\(extracel lularregulated protein kinases1/2，ERK1/2\\)通路和血管內皮細胞有關，以揭示慢性缺氧性肺血管收縮的機制。

1、材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑:15-KETE購于美國Biomol公司，U0126購于Calbiochem公司，其他試劑均為市售國產分析純。

1.1.2主要儀器設備:肌肉張力換能器\\(JZ101，高碑店市新航機電設備有限公司\\);生物信號采集處理系統\\(Medlab-U-6.0，南京美易科技有限公司\\)，體式解剖顯微鏡\\(SMZ-168，Motic\\)。

1.1.3實驗動物:實驗用清潔級雄性Wistar大鼠，體質量為\\(220±20\\)g，由哈爾濱醫科大學實驗動物學部提供［SCXK\\(黑\\)2013-001］。

1.2方法

1.2.1缺氧動物模型制備:參見文獻，將16只健康的Wistar大鼠隨機分為兩組\\(n=8\\)，一組置于正常的培養箱中，其吸入氧\\(FiO2\\)濃度為21%，作為正常對照組;一組置于缺氧的培養箱中，其吸入氧濃度為10%作為缺氧組，連續飼養9d，培養箱內大鼠呼出的CO2、水蒸氣分別用氧化鈣和無水氯化鈣吸收，排出的氨氣由硼酸吸收，大鼠自由采食和飲水。

1.2.2肺動脈血管環張力測定:9d后，用戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，開胸取出肺臟，游離直徑0.5—1.0mm肺動脈\\(PA\\)，剪成長約3mm血管環，懸掛在兩個鎢絲三角環上，一端掛在塑料支架下面的鐵鉤上，另一端掛在張力換能器的電極上，置于盛有4mL含95%O2－5%CO2混合氣的Krebs液中\\(mmol/L:NaCl118，KCl4.7，CaCl22.5，MgSO40.57，KH2PO41.2，NaHCO324，葡萄糖10，pH7.4，37℃\\)的恒溫浴槽內。在30min內逐漸給肺動脈環負荷0.3g的基礎張力，平衡1h。肺動脈環的收縮張力信號通過Medlab-U-6.1生物信號采集處理系統的多通道接頭傳輸到計算機相應處理軟件進行數據記錄和分析。

1.3實驗設計

1.3.115-KETE對正常對照組和缺氧組大鼠肺動脈血管環張力的影響:Krebs液中加入15-KETE的濃度依次從10－8mol/L增加至10－6mol/L，當血管環的張力在一濃度下達到峰值5min后，再加入另一濃度的15-KETE，根據血管環的張力變化繪制出15-KETE濃度反應曲線。

1.3.2去除內皮對15-KETE誘導缺氧大鼠離體肺動脈環收縮力的影響:在上述試驗的基礎上，選擇15-KETE收縮肺動脈環的最佳濃度，觀察內皮完整和除去血管內皮后，15-KETE對肺動脈血管環收縮作用的影響。用表面粗糙的金屬絲在血管腔內來回穿動5—8次去除內皮，用重酒石酸去甲腎上腺素10－6mol/L收縮血管，然后加入10－6mol/L的乙酰膽堿，若引起舒張反應小于10%，可認定為內皮失去功能。用上述去內皮血管作為實驗組，加入收縮肺動脈環最佳濃度的15-KETE，以內皮完整的正常血管環作為對照組，比較張力變化。

1.3.3抑制劑U0126對15-KETE誘導缺氧大鼠離體肺動脈環收縮力的影響:在上述試驗的基礎上，選擇15-KETE收縮肺動脈環的最佳濃度，觀察15-KETE收縮大鼠離體肺動脈環的作用，然后用Krebs液沖洗浴槽3—4次，基線恢復到0.3g的基礎張力，平衡1h后，在Krebs液中加入ERK1/2抑制劑U0126作用15min，在上述抑制劑存在的條件下，再加入縮肺動脈環最佳濃度的15-KETE，觀察抑制ERK1/2后，15-KETE對大鼠肺動脈環收縮力的影響。

1.3.4除內皮動脈環并經U0126孵育對15-KETE誘導缺氧大鼠離體肺動脈環收縮力的影響:機械法去除血管內皮，檢測內皮是否完整去除的方法是乙酰膽堿產生的血管舒張幅度小于異丙腎上腺素預收縮幅度的10%。選擇收縮肺動脈環的最佳15-KETE濃度，觀察其收縮大鼠離體肺動脈環的作用，然后用Krebs液沖洗浴槽3—4次，基線恢復到0.3g的基礎張力，平衡1h后，在Krebs液中加入ERK1/2抑制劑U0126作用15min，在上述抑制劑存在的條件下，再加入縮肺動脈環最佳濃度的15-KETE，觀察抑制ERK1/2后，15-KETE對去內皮的大鼠肺動脈環收縮力的影響。

1.4統計方法

血管環數據以對靜息張力的百分數表示，即收縮率以用藥后收縮幅度/用藥前收縮幅度×100%來表示;所有數據均以x珋±s表示;組內比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett-t檢驗分析，P＜0.05為有顯著差異。

2、結果

2.115-KETE對正常對照組和缺氧組大鼠肺動脈血管環張力的影響

在pH7.4含95%O2－5%CO2混合氣的37℃Krebs液中，15-KETE以濃度\\(10－8mol/L—10－6mol/L\\)依賴方式收縮缺氧大鼠離體肺動脈環，其中10－6mol/L15-KETE、10－7mol/L15-KETE對缺氧組離體肺動脈環的收縮力影響顯著高于正常組\\(P＜0.05\\);10－6mol/L15-KETE對離體肺動脈環的收縮力影響極顯著高于10－8mol/L15-KETE的收縮力\\(P＜0.01\\);10－7mol/L15-KETE對離體肺動脈環的收縮力影響顯著高于10－8mol/L15-KETE的收縮力\\(P＜0.05\\)\\(見圖1\\)。

2.2去除內皮對15-KETE誘導缺氧大鼠離體肺動脈環收縮力的影響

為了明確血管內皮細胞在15-KETE收縮缺氧大鼠肺動脈血管環中的作用，在pH7.4含95%O2－5%CO2混合氣的37℃Krebs液中，加入終濃度為10－6mol/L15-KETE后，肺動脈環收縮率為\\(191.67±15.92\\)%;我們通過機械法除去血管內皮細胞，在Krebs液平衡1h后，再給予10－6mol/L15-KETE后，肺動脈環收縮率為\\(145.96±9.53\\)%，與去除內皮前給予10－6mol/L15-KETE的結果有顯著性差異\\(P＜0.05\\)，說明內皮細胞在15-KETE收縮缺氧大鼠離體肺動脈環中起一定作用\\(見圖2\\)。

2.3抑制劑U0126對15-KETE誘導缺氧大鼠離體肺動脈環收縮力的影響

為了明確ERK1/2通路在15-KETE收縮缺氧大鼠肺動脈血管環中的作用，在pH7.4含95%O2－5%CO2混合氣的37℃Krebs液中，加入終濃度10－6mol/L15-KETE，肺動脈環收縮率為\\(196.87±17.46\\)%;當肺動脈環用150nmol/LERK1/2抑制劑U0126孵育30min后，再給予10－6mol/L15-KETE，結果肺動脈環收縮率為\\(148.57±15.16\\)%，與孵育前給予10－6mol/L15-KETE的結果差異顯著\\(P＜0.05\\)，說明ERK1/2通路參與15-KETE誘導的缺氧大鼠肺動脈環收縮\\(見圖3\\)。

2.4檢測除內皮動脈環并經U0126孵育。

對15-KETE誘導缺氧大鼠離體肺動脈環收縮力的影響通過機械法除去血管內皮細胞，在pH7.4含95%O2－5%CO2混合氣的37℃Krebs液中，加入終濃度10－6mol/L15-KETE，結果其收縮為\\(149.43±9.63\\)%;當肺動脈環用150nmol/LERK1/2抑制劑U0126孵育30min后，再給予10－6mol/L15-KETE，肺動脈環收縮率為\\(124.34±6.21\\)%，與孵育前給予10－6mol/L15-KETE的結果差異顯著\\(P＜0.05\\)，說明位于平滑肌的ERK1/2通路參與了15-KETE誘導缺氧大鼠肺動脈環的收縮\\(見圖4\\)。

3、討論

目前慢性缺氧性肺血管收縮機制尚不完全清楚。15-KETE是動脈的15-脂質氧化酶\\(15-LO\\)一種代謝終產物。由于缺氧可上調肺動脈平滑肌細胞15-LO的表達，因此，15-KETE在肺動脈平滑肌細胞上有其相應的細胞分布及相應的作用位點。我們先前研究表明，15-KETE以濃度依賴性方式強烈收縮離體肺動脈環，并且收縮作用依賴于Kv通道、細胞外液鈣離子和L–型鈣離子通道，15-KETE可能是缺氧情況下介導肺血管收縮的因子。由此推論慢性缺氧誘導15-KETE產量增加，進而可能調節與血管收縮有關的信號轉導系統或收縮蛋白的表達或活性，使肺動脈環反應性增強。我們還發現15-KETE阻斷電壓依賴鉀通道\\(Kv通道\\)引起膜去極化，增加細胞內鈣離子濃度，但15-KETE引起缺氧性肺動脈環收縮的信號轉導通路的研究尚未見報道。

有絲分裂素活化蛋白激酶\\(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK\\)級聯途徑是哺乳動物細胞中重要的信號通路。MAPK途徑大致分為4種:ERK1/2途徑、JNK途徑、p38途徑和ERK5途徑。

它們參與了多種神經遞質、激素、生長因子、細胞因子及應激刺激對細胞生理活動的調節。

ERK1/2途徑是脊椎動物中克隆的第1個MAPK途徑，也是闡述最完全的經典途徑。它的激活需要其Tyr和Ser/Thr基團同時被磷酸化。U0126是ERK1/2上游激酶的抑制劑，可抑制ERK1/2的活化，阻斷ERK1/2信號轉導通路。我們用U0126孵育內皮完整的缺氧性肺動脈血管環，發現15-KETE的縮血管作用明顯受到抑制，說明15-KETE經ERK1/2通路收縮慢性缺氧性大鼠肺動脈環。去除內皮以后，U0126仍可抑制15-KETE的縮血管作用，說明此通路位于血管平滑肌內，由此提示15-KETE經血管平滑肌內ERK1/2通路收縮慢性缺氧性大鼠肺動脈。

本研究通過血管環和離子通道特異性抑制劑的應用，從功能上探討了15-KETE收縮肺動脈血管的可能的離子通道機理，揭示ERK1/2通路和內皮細胞在15-KETE收縮缺氧大鼠肺動脈環中起一定作用，上述結論尚需從基因和蛋白質水平加以證實。