成纖維細胞作為動脈外膜最主要的細胞成分，在環境因素發生改變時具有調整其表型的能力。在血管內皮損傷的模型中，外膜表現出了顯著增厚，其主要就是由于外膜成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞聚集引起的。但是關于動脈粥樣硬化早期血管外膜成纖維細胞表型轉化的報道甚少，本研究將通過整體動物及體外實驗觀察載脂蛋白E基因敲除\\(ApoE－/－\\)小鼠血管外膜成纖維細胞表型的變化，探討血管外膜成纖維細胞表型轉變在早期動脈粥樣硬化病灶形成中的作用。

1、材料與方法

1.1主要材料

6周齡ApoE－/－小鼠和C57BL/6鼠購于北京大學醫學部。DMEM培養基、胎牛血清購于美國Gibicol公司。兔多克隆抗體轉化生長因子β1\\(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1\\)購于美國SantaCruz公司;抗小鼠波形蛋白\\(vimentin\\)抗體、抗小鼠結蛋白\\(desmin\\)抗體及抗小鼠α平滑肌肌動蛋白\\(α-smoothmuscleactin，α-SM-actin\\)抗體購于美國NeoMarkers公司;鼠組織免疫組織化學試劑盒購于福州邁新試劑公司;兔即用型SP免疫組織化學試劑盒購于北京中杉金橋生物技術公司;鏈霉親和素-生物素-異硫氰酸酯\\(streptavidin-biotincomplex-fluoresceineisothiocya-nate，SABC-FITC\\)及鏈霉親和素-生物素-cy3\\(streptavidin-biotincomplex-cy3，SABC-cy3\\)試劑盒購于武漢博士德公司。DAPI購于美國Sigma公司。

1.2標本制備

6周齡ApoE－/－小鼠和野生型C57BL/6小鼠，分別給予高脂飼料\\(基礎飼料84.75%，飽和脂肪15%，膽固醇0.25%\\)喂養2周、4周和8周。在各個時間點處死動物后取升主動脈用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制備連續切片。

1.3免疫組織化學染色

選取部分切片進行免疫組織化學染色檢測α-SM-actin和Vimentin的表達，按鼠組織免疫組織化學試劑盒說明書操作。按兔即用型SP免疫組織化學試劑盒說明檢測Desmin的表達。部分切片進行免疫熒光染色檢測TGF-β1的表達，按SABC-cy3試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4血管外膜成纖維細胞的培養

6周齡野生型C57BL/6小鼠和ApoE－/－小鼠，高脂喂養2周后，頸椎脫臼處死，無菌開胸取出整條主動脈，仔細清除血細胞及血管周圍脂肪組織，解剖顯微鏡下小心剝離外膜。用眼科剪將組織剪碎成約1mm3小塊，接種到培養瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培養基，于37℃、5%CO2干涸培養2～4h待組織塊貼牢后輕輕翻轉培養瓶繼續靜置培養，觀察大部分組織塊周圍爬出細胞，融合成片時，用0.25%胰蛋白酶消化并采用差速貼壁法純化兩次。

選取第3～5代細胞，進行后續實驗。

1.5免疫熒光染色檢測體外培養成纖維細胞中Vi-mentin、α-SM-actin和Desmin的表達

取對數生長期細胞，0.25%的胰酶將細胞消化成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×108cells/L，接種于帶爬片的6孔板中，靜置培養48h待細胞長至亞融合狀態后，血清饑餓24h，然后更換含有10%胎牛血清的DMEM，繼續培養24h，棄去培養液，取出細胞爬片。PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定20min。然后PBS沖洗3遍，3%過氧化氫室溫孵育15min，以消除內源性過氧化物酶。之后Vimentin免疫熒光染色按SABC-FITC試劑盒進行，α-SM-actin及Desmin免疫熒光染色按SABC-cy3試劑盒進行。

1.6透射電鏡觀察細胞超微結構

取對數生長期的細胞，用0.25%胰酶消化細胞成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×109cells/L，接種于新培養瓶中，后靜置培養48h待細胞長至亞融合狀態，血清饑餓24h，更換含10%胎牛血清的DMEM，繼續培養24h，然后收集細胞［約\\(15～20\\)×106個培養細胞］，經過固定、漂洗、脫水、滲透包埋與聚合、切片、染色后透射電鏡下觀察細胞超微結構。

1.7WesternBlot檢測α-SM-actin及TGF-β1蛋白的表達

收集細胞加入100μL細胞裂解液，冰上孵育20min，10000×g離心5min，取各組細胞的裂解液10μL，各加入5μL上樣緩沖液，混勻。水中煮沸3～5min，10000×g離心1min，冰上放置，上樣。經電泳、考馬斯亮蘭染色、脫色，轉膜，封閉后加入一抗α-SM-actin或TGF-β1，4℃雜交過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育1h，洗膜，化學發光法顯色。結果作半定量分析。

1.8統計學分析

檢測結果均用x±s表示，采用軟件SPSS11.5進行分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有顯著性。

2、結果

2.1免疫組織化學染色檢測血管外膜α-SM-actin的表達

各個時間點的ApoE－/－小鼠血管外膜大部分細胞呈現Vimentin陽性表達，Desmin始終呈陰性，而中膜細胞對Vimentin、Desmin、α-SM-actin三種單抗均呈陽性反應。高脂喂養2周的ApoE－/－小鼠血管外膜部分細胞檢測到α-SM-actin陽性表達，此時并無可見內膜病灶形成，高脂喂養4周后內膜出現泡沫細胞，血管外膜α-SM-actin陽性表達增多，但8周后外膜α-SM-actin呈弱陽性表達，此時內膜動脈粥樣硬化病灶進一步發展，內膜α-SM-actin表達呈陽性。而C57BL/6小鼠血管外膜細胞只檢測到Vimentin陽性表達，始終未檢測到α-SM-actin陽性表達\\(圖1\\)。

2.2免疫熒光染色檢測TGF-β1表達

6周齡ApoE－/－小鼠\\(高脂喂養前\\)和各個時間點的C57BL/6小鼠主動脈外膜細胞均無TGF-β1的表達，高脂喂養2周后，ApoE－/－小鼠主動脈外膜細胞呈現TGF-β1弱陽性表達。高脂喂養4周后，主動脈外膜細胞TGF-β1表達增強，此時內膜損傷處呈現TGF-β1弱表達，高脂喂養8周后主動脈外膜和內膜損傷處呈現TGF-β1強陽性表達\\(圖2\\)。

2.3免疫熒光染色檢測體外培養成纖維細胞Vim-entin、α-SM-actin和Desmin

ApoE－/－小鼠血管外膜成纖維細胞除了Vimen-tin染色陽性外，還有部分細胞表現為α-SM-actin染色陽性，但Desmin染色一直呈陰性。C57BL/6小鼠血管外膜成纖維細胞僅表現為Vimentin染色陽性，而Desmin和α-SM-actin均呈陰性反應\\(圖3\\)。

2.4透射電鏡觀察細胞超微結構

C57BL/6小鼠血管外膜細胞主要表現出典型成纖維細胞的特征，細胞呈梭形或者不規則形，有多個較長的胞質突起，核為卵圓形，偶見微管微絲。而ApoE－/－小鼠血管外膜細胞有部分細胞的超微結構發生改變，可見肌絲明顯增多，呈現出肌成纖維細胞的特征\\(圖4\\)。

2.5α-SM-actin及TGF-β1蛋白的表達

ApoE－/－小鼠成纖維細胞α-SM-actin\\(5.102±0.896\\)及TGF-β1\\(7.573±1.043\\)蛋白表達水平都明顯高于C57BL/6小鼠\\(0.126±0.521和0.279±0.769\\)，差異有顯著性\\(P＜0.05;圖5\\)?！緢D１５】

3、討論

血管外膜長期以來被認為只是充當內皮損傷始動動脈粥樣硬化病灶形成的“配角”，隨著研究的深入，越來越多的證據顯示外膜可以通過由外而內的作用影響血管中膜及內膜。外膜是多種血管活性因子的主要來源，是血管重塑過程中的重要參與者。

血管外膜發生的變化\\(如結締組織生成增多、炎癥反應以及細胞改變等\\)可能是即將發生的血管疾病的信號。在對損傷的反應過程中，外膜細胞可表現出不同的結構和功能行為，有報道在中度和重度球囊損傷實驗模型中外膜的成纖維細胞表型轉化為肌成纖維細胞。動脈損傷后早期血管外膜成纖維細胞逐漸轉化為肌成纖維細胞。成纖維細胞的表型轉化和增殖活性改變參與并促進了血管橋再狹窄的發生過程。在移植性血管病模型中發現新生內膜增生之前外膜即出現大量a-SM-actin陽性的肌成纖維細胞。但是關于動脈粥樣硬化早期血管外膜成纖維細胞表型轉化的報道甚少。本實驗觀察了ApoE－/－小鼠動脈粥樣硬化病灶形成過程中血管外膜成纖維細胞表型的變化。結果發現高脂喂養2周和4周后的ApoE－/－小鼠血管外膜細胞發生了表型改變，其在逐漸獲得α-SM-actin表達的同時，Desmin染色持續陰性，Vimentin則持續呈陽性表達。Vimentin為間質細胞標記物，Desmin則是高分化平滑肌細胞的標記物，結果顯示所測細胞為成纖維細胞，并表現出向肌成纖維細胞轉化的特征。體外培養成纖維細胞結果也證實ApoE－/－小鼠血管外膜部分細胞的超微結構發生改變，可見肌絲明顯增多，呈現出肌成纖維細胞的特征。免疫熒光染色除Vimentin染色陽性外，還有部分細胞表現為α-SM-actin染色呈陽性，但Desmin染色一直呈陰性，結果說明ApoE－/－小鼠血管外膜細胞仍保持了成纖維細胞的表型特點，但有部分轉化為肌成纖維細胞，而非典型平滑肌細胞。肌成纖維細胞是一種具有平滑肌細胞樣特點的成纖維細胞。它也能分泌細胞外基質和多種生物活性因子參與組織修復，一旦創傷愈合，肌成纖維細胞迅速回轉到成纖維細胞或進入凋亡。

本研究結果顯示高脂喂養8周后的ApoE－/－小鼠血管外膜呈現α-SM-actin弱陽性表達，這可能表示肌成纖維細胞向內膜遷移，或又轉為成纖維細胞，或進入凋亡。

許多生長因子，如血小板源生長因子\\(PDGF\\)、TGF-β、腫瘤壞死因子α\\(TNF-α\\)和堿性成纖維細胞生長因子\\(bFGF\\)等都參與了成纖維細胞表型轉化的過程。其中TGF-β1參與了多種細胞的增殖及分化，其可誘導大鼠腹膜間皮細胞轉化。大鼠肺動脈高壓的肺組織中TGF-β1表達水平也顯著增高。TGF-β1是目前公認的能直接誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞進行表型轉化的誘導因子。

我們在實驗中也觀察到ApoE－/－小鼠隨著高脂喂養時間延長，主動脈外膜TGF-β1的表達增加，從而促使成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞。體外實驗結果也顯示ApoE－/－小鼠血管外膜成纖維細胞中TGF-β1蛋白表達水平明顯高于C57BL/6小鼠。成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞后又會分泌基質蛋白、細胞因子等，進行大量增殖，并且遷移到新生內膜中，可促進平滑肌細胞和內皮細胞的增殖。增多的細胞外基質又可進一步促進成纖維細胞增殖及表型轉化來參與血管重塑。因此成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞后將有助于動脈粥樣硬化病灶形成。

本研究結果提示動脈粥樣硬化病灶形成早期血管外膜成纖維細胞即出現表型轉變為肌成纖維細胞的特性，從而影響外膜和血管中膜及內膜之間的交互對話，參與動脈粥樣硬化病灶的形成及進展，這可能成為抑制不良血管重塑的干預靶點。

參考文獻：
［1］Jin X，Fu GX，Li XD，et al． Expression and function ofosteopontin in vascular adventitial broblasts and pathologi-cal vascular remodeling［J］． PLoS One，2011，6\\( 9\\) : e23558．
［2］Siow RC，Churchman AT． Adventitial growth factor signal-ling and vascular remodelling: potential of perivasculargene transfer from the outside-in［J］． Cardiovasc Res，2007，75\\( 4\\) : 659-668．
［3］Ruan CC，Zhu DL，Chen QZ，et al． Perivascular adiposetissue-derived complement 3 is required for adventitial bro-blast functions and adventitial remodeling in deoxycortico-sterone acetate-salt hypertensive rats ［J］． ArteriosclerThromb Vasc Biol，2010，30 \\( 12\\) : 2 568-574．
［4］Li G，Chen SJ，Oparil S，et al． Direct in vivo evidencedemonstrating neointimal migration of adventitial fibroblastsafter balloon injury of rat carotid artery［J］． Circulation，2000，101\\( 12\\) : 1 362-365．
［5］聶如瓊，王景峰，伍 衛，等． 損傷動脈外膜重塑和成纖維細胞表型的變化［J］． 中國動脈硬化雜志，2002，10\\( 4\\) : 288-290．
［6］邱志兵，陳 鑫，萬 松，等． 豬靜脈橋血管重建中平滑肌細胞和成纖維細胞表型轉化［J］． 中國動脈硬化雜志，2008，16\\( 7\\) : 532-536．
［7］Ji J，Xu F，Li L，et al． Activation of adventitial broblastsin the early stage of the aortic transplant vasculopathy in rat［J］． Transplantation，2010，89\\( 8\\) : 945-953．
［8］劉小賢，張 浩，孫 劍，等． TGF-β1對大鼠腹膜間皮細胞轉分化的影響及其機制［J］． 中南大學學報\\( 醫學版\\) ，2010，35\\( 2\\) : 159-164．
［9］朱 蓉，賀 亮，徐軍美，等． 高血流性肺動脈高壓大鼠肺組織中 TGF-β1和 CTGF 的動態變化及意義［J］． 中南大學學報\\( 醫學版\\) ，2012，37\\( 10\\) : 1 013-020．
［10］Gao PJ，Li Y，Sun AJ，et al． Differentiation of vascularmyo broblasts induced by transforming growth factor-beta1requires the involvement of protein kinase Calpha［J］． JMol Cell Cardiol，2003，35 \\( 9\\) : 1 105-112．
［11］ Coen M，Gabbiani G，Bochaton-Piallat ML． Myofibro-blast-mediated adventitial remodeling: an underestimatedplayer in arterial pathology［J］． Arterioscler Thromb VascBiol，2011，31\\( 11\\) : 2 391-396．
［12］徐 芳，劉 穎，石 磊，等． 載脂蛋白 E 基因敲除小鼠動脈粥樣硬化早期血管外膜成纖維細胞增殖活性增強［J］． 中國病理生理雜志，2010，26\\( 8\\) : 1 503-508．
［13］ Desmouliere A，Chaponnier C，Gabbiani G． Tissue re-pair，contraction，and the myo broblast［J］． Wound Re-pair Regen，2005，13 \\( 1\\) : 7-12．
［14］Hinz B，Gabbiani G． Fibrosis: recent advances in myofi-broblast biology and new therapeutic perspectives［J］．F1000 Biol Rep，2010，11\\( 2\\) : 78-83．