干細胞移植治療心肌缺血可以促進梗塞心肌的血管增生、減少心肌梗塞的面積，改善心肌功能。被移植的干細胞進入心肌缺血體內，到達缺血部位后，可以通過變形、游走方式進入缺血組織，在缺血缺氧環境下分化成血管內皮細胞。
干細胞同時可以分泌各種血管因子，如Angiopoitine-1,\\(vascular endothelial growth factor,VEGF）等，其中還包括胎盤生長因子\\(Placental growth factor,PlGF\\)。PlGF因子是家族中的一員，PlGF已經被證實在大腦、下肢缺血動物模型中具有促進新的血管生成，改善局部循環的血流狀態的作用。本實驗中，在心肌缺血發生后一周后，靜脈移植人間充質干細胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）及PlGF基因修飾的hMSCs（PlGF-hMSCs），并在移植后一個月觀察大鼠心肌PlGF蛋白表達水平以及血管增生情況。在本實驗中，hMSCs和PIGF高分泌功能的PlGF-hMSCs，在心肌缺血的一周后給與靜脈注射移植，并在移植后的一周、一個月觀察大鼠心肌PlGF蛋白表達水平以及血管增生情況。
1、材料和方法
1.1干細胞培養及腺病毒轉染
將健康人志愿者的間充質干細胞放入10%FBS的DMEM/F12培養液內，置于37℃，5%的CO2孵箱培養。本實驗采用腺病毒進行轉染，即hMSCs按照2×106濃度接種于10%FBS的DMEM/F12培養液中，與預先制成的AxCAhPlGF-F/RGD或AxCALacZ-F/RGD腺病毒質?；旌?0分鐘進行轉染，細胞感染復數\\(multiplicityofinfection,MOI\\)為3×103。使用DMEM清洗后常規保存24小時，準備移植使用。
細胞移植之前離心收集。
1.2大鼠心肌缺血模型
選取體重280-320g雄性Sprague Dawley大鼠,氯胺酮50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定于手術臺，氣管插管，行呼吸機支持。開胸，打開心包暴露心臟，找出冠狀動脈左前降支，結扎左前降支根部，逐層關閉胸腔。60min后松開活結，使冠狀動脈血流再通。隨機分為3組:對照組\\(DMEM組\\)6只;hMSCs移植組6只；PIGF-hMSCs組6只。動物用戊巴比妥\\(30mg/kg\\)腹腔麻醉，行左側開胸術暴露心臟，結扎冠狀動脈左前降支。關胸后放回籠中飼養。術后一周后使用股靜脈注射方法靜脈移植。每只大鼠經靜脈移植hMSCs數目為2×106。
1.3PIGF蛋白測試
體外轉染hMSCs48小時后，離心提取上清液。使用PlGFELISA\\(enzyme-linked、immunosorbent、assay\\)試劑盒\\(R&DSystemsInc.,Minneapolis,USA\\)進行測試。
1.4心肌梗塞體積測定
心肌梗死后一月取出大鼠心臟。生理鹽水洗洗凈，放置-20℃凍存2min，從心尖至心底橫切成1mm厚的心室組織切片。將切片置于1%TTC\\(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride\\)溶液中，在37℃條件下進行染色。則非心肌梗死區染色為紅色，梗死區不染色。數字成像后，接入電腦圖像分析系統測定左室及梗塞區面積與正常側的面積百分比。
1.5觀察測定血管新生
移植后一個月，全麻狀態下靜脈注射異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖（FITCdextran）（Sigma）1ml，然后將大鼠開胸取出心臟，浸入4%福爾馬林4℃保存48小時。制成100μm厚切片，在共聚焦顯微鏡（LSMPascal;Carl、Zeiss）20倍物鏡下觀察心肌缺血的交界處。掃描視野為512×512像素（651.5μm×651.5μm）,掃描厚度2.4μm，并使用ZeissLSM軟件計算出毛細血管體積，每個層面取五個視野計算平均值。最后用患側毛細血管體積與健側相同位置毛細血管體積相比，得出數值進行分析。
1.6免疫染色
觀察PlGF-hMSCs在發生梗塞的心肌是否分化成血管內皮細胞，在大鼠心肌梗塞1周后靜脈移植LacZ標識的PlGF-hMSCs。移植后一個月，取出大鼠心臟，用4%福爾馬林浸泡24小時后冷凍。切成10μm后的切片。雙重染色法染色。使用的抗體包括β-galactosidase\\(rhodamine-labelled polyclonal rabbit anti-b-galactosidase anti-body,DAKO\\)和抗體[FITC-labelled polyclonal rabbitanti-von Will-brand Factor\\(vWF\\),DAKO]。圖片合成由Zeiss軟件完成。觀察使用共聚焦顯微鏡觀察LacZ轉染的PlGF-hMSCs在缺血心肌的分布情況。
統計分析
統計每組數據,數據以平均值±標準差的形式表示，實驗組間的數據用SPSS10.0統計軟件分析比較，P值<0.05為有統計學意義。
2、結果
PlGF在各組的invitro值，在MOI分別為300,1000,3000的條件下，PlGF測得Lacz-hMSCs組依次為0.05±0.02；0.07±0.03；0.15±0.08ng/105cell/48hr；PlGF-hMSCs組的PlGF蛋白表達量依次為：1.45±0.17；2.14±0.35；5.12±0.72ng/105cell/48hr。PlGF-hMSCs組的PlGF蛋白表達量明顯高于LacZ-hMSCs對照組，并且MOI在3000時，PlGF蛋白表達量為最高（表1）。
大鼠心肌梗塞一周，靜脈移植后一個月后心肌梗塞體積與健側的百分比，DMEM、hMSCs、PlGF-hMSCs各組（n=6）分別為49.50±4.50%；41.73±2.05%；33.02±3.71%。據以上結果可以看出，hMSCs以及PlGF-hMSCs移植后，心肌梗塞體積縮小，并且PlGF-hMSCs縮小得更加明顯。差異具有統計學意義（p<0.05）（表2）。
大鼠心肌梗塞一周，靜脈移植后一個月后得出患側與健側的毛細血管比值。DMEM、hMSCs、PlGF-hMSCs各組的比值分別為0.2±0.05；0.69±0.093；1.45±0.47。hMSCs及PlGF-hMSCs移植后，梗塞邊界處毛細血管新生明顯，PlGF-hMSCs組的毛細血管新生更為明顯。差異具有統計學意義（p<0.05）（表3）。
大鼠心肌梗塞一周，經靜脈移植LacZ-hMSCs細胞，一個月后對心肌切片進行雙重免疫染色?？梢娨浦驳膆MSCs分化成為血管內皮細胞（圖1）。
討論通過以上實驗，我們證實了在心肌梗塞的亞急性期（一周），經靜脈移植hMSCs及PlGF-hMSCs后，可以提高梗塞區域的PlGF表達，促進血管新生，縮小心肌梗塞體積。以往的相關實驗證實了當心肌或下肢缺血后給予PlGF因子可以促進產生“母血管”，而后再逐漸形成穩定的、增大的成熟血管。具有這樣特征的血管的功能可以持續保留至少一年，或者更長的時間。而PlGF與同類血管增生因子如VEGF、Ang-1相比，有著可以避免組織水腫、纖維素沉積以及新生血管穩定性差的情況。盡管國內外有很多關于各種因子轉染干細胞移植治療心肌梗塞的報道，但是使用PlGF因子轉染干細胞治療心肌梗塞尚屬首次。有關研究報道了PlGF在缺血組織的過量表達，提示了PlGF因子有可能在治療組織缺血方面起著重要的作用。
而本實驗結果也證實了我們的假設。
我們選擇了亞急性期進行移植，在梗塞缺血發生的急性期，毛細血管結構仍然完整，而到了亞急性期，缺血區域的毛細血管壁會出現通透性增加，這樣干細胞攜帶PlGF會有更多機會進入缺血區域，從而發揮更大的治療作用。同時還考慮到在實際臨床治療中，患者在急性期發病一般需要采取介入支架治療或溶栓等治療。所以未來細胞移植成為一種臨床治療手段時，在患者心梗發生的亞急性期可能有更大的使用空間。我們有充分的理由期待PlGF基因轉染干細胞在將來的心肌梗塞的治療中發揮重要的作用。
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