酒在人類社交活動中起著至關重要的作用，但過量飲酒可導致全身各臟器受損，如腦、心血管系統、胃腸道等，尤以肝臟受損最為突出，過度飲酒導致的死亡人數占全球人口死亡的3.8%。在中國，肝臟疾病以肝炎病毒感染多見，其次，酒精性肝病\\(alcoholi cliver disease\\)的發生率有增加趨勢，已成為僅次于病毒性肝炎的第二肝病病因，飲酒與肝臟的關系也日益受到重視，而追求一種對身體健康損害較小的酒類是當前人們最為關心的話題。2012年3—10月，本研究選用市面上常見的某品牌53度醬香型白酒為實驗用白酒，并選擇高、中、低3種不同的劑量，通過對3種不同飲用劑量之間的比較以及與530g/L乙醇的對照，觀察飲用該白酒在機體的代謝過程是否與單純乙醇存在異同，初步探討飲酒與健康的關系。
1、材料與方法
1．1材料
1．1．1白酒和乙醇實驗用醬香型白酒［\\(53±2\\)g/L，V/V］，由貴州糧油進出口公司4部提供;無水乙醇\\(分析純，上海振興化工一廠出品，批號201208302\\)。
1．1．2動物雄性Wistar大鼠75只，清潔級，體質量\\(180±20\\)g，購自第三軍醫大學實驗動物中心［SCXK\\(渝\\)2007－0003］。普通飼料喂養，自由飲水，自然采光，室溫15～25℃，實驗前適應環境1周。
1．1．3試劑超氧化物歧化酶\\(super oxide dismutase，SOD\\)、丙二醛\\(malondialdehyde，MDA\\)、谷胱甘肽過氧化物酶\\(glutathione peroxidase，GSH－PX\\)、乙醇脫氫酶\\(alcohol dehydrogenase，ADH\\)、乙醛脫氫酶\\(acetalde-hy dedehydrogenase，ALDH\\)試劑盒\\(南京建成生物工程研究所，批號:20110229，20110228，20110228，20110317，20110307\\)，SYBRGreen試劑盒\\(北京天根生化科技有限公司，批號:K9929\\)，逆轉錄試劑盒\\(加拿大FermentasMBI公司，批號:00087036\\)，Trizol試劑\\(美國Invitrogen公司，批號:28216\\)，EnVision試劑盒［基因科技\\(上海\\)有限公司，批號:25F1777A］，電化學發光\\(ECL\\)試劑盒\\(美國Millipore公司，批號1219101\\)，全蛋白提取試劑盒\\(南京凱基生物科技發展有限公司，批號KGP250\\)，BCA蛋白定量試劑盒\\(美國ThermoSCIENTIFIC公司，批號:23227\\)，ADH1、AL-DH2、β－actin一抗分別購自英國Abcam、美國Sigma公司。ADH1上、下游引物序列分別為5'－CTGTGG-TAGATGACATAGCGGT－3'和5'－GGTTTGGTG-TAGTCTTGAGGGT－3'，1804bp;ALDH2上、下游引物序列分別為5'－TGTCTCCGCTATTATGCTGGCT－3'和5'－ATGATGATATTGGGGCTCTTTC－3'，1889bp;β－actin上、下游引物序列分別為5'－TCCTCCTGAGCG-CAAGTACTCT－3'和5'－GCTCAGTAACAGTCCGC-CTAGAA－3'，1536bp。均由上海生工生物工程有限公司合成。
1．1．4主要儀器氣相色譜柱20%PEG20M\\(100～120目\\)，2m×2mm\\(南京伽諾儀器儀表有限公司\\)，SP－1000氣相色譜儀\\(北京北分瑞利儀器有限公司\\)，核酸定量儀\\(美國Amersham Biosciences公司\\)，核酸擴增實時熒光檢測系統\\(DA7600型\\)\\(中山大學達安基因股份有限公司\\)，GelDocEQ凝膠成像儀\\(美國Bio－Rad公司\\)，顯微圖像采集系統\\(日本Olympus公司\\)。
1．2方法
1．2．1動物分組及處理大鼠隨機分為空白對照組\\(A組\\)，乙醇組\\(B組\\)，白酒高\\(C組\\)、中\\(D組\\)、低劑量組\\(E組\\)，每組15只。A組以生理鹽水5mL/kg灌胃，B～E組分別以乙醇5mL/kg\\(用蒸餾水稀釋至530g/L體積分數\\)，醬香型白酒10、5、2.5mL/kg\\(用蒸餾水稀釋1倍\\)灌胃，1次/d，共7d。全部大鼠于末次灌胃1、12h后眼眶采血，然后股動脈放血處死，常規留取血清，先測定末次灌胃1h后血清乙醇濃度，再測定末次灌胃12h后血清丙氨酰氨基轉移酶\\(ALT\\)、草氨酰氨基轉移酶\\(AST\\)活性和乙醇、乙醛濃度;留取全部肝臟，測定各組大鼠肝組織勻漿SOD、MDA、GSH－PX、ADH、ALDH含量，測定肝組織中ADH1、ALDH2mRNA和蛋白質的表達水平。
1．2．2主要檢測指標及方法1．2．2．1ALT、AST活性及乙醇、乙醛濃度的檢測Siemens Advia1650全自動生物化學分析儀測定ALT、AST活性，頂空氣相色譜法檢測血中乙醇、乙醛濃度。
1．2．2．2SOD、MDA、GSH－PX、ADH、ALDH的檢測按試劑盒方法測定肝組織勻漿SOD、MDA、GSH－PX，根據文獻［9－10］測定肝組織勻漿ADH、ALDH含量。
1．2．2．3RT－PCR檢測ADH1、ALDH2mRNA的表達采用Trizol－酚－氯仿一步法提取總RNA并純化，測定RNA濃度，逆轉錄合成cDNA后行RT－PCR。實驗過程中以β－actin作內對照，進行標準化轉換得到各樣本的拷貝數\\(Ct值\\)，以Ct值的均數來反映目的基因的表達。
1．2．2．4免疫組織化學法檢測ADH1、ALDH2的表達采用EnVision二步法，切片常規脫蠟，抗原熱修復，分別用ADH1抗體\\(1∶300\\)、ALDH2抗體\\(1∶300\\)4℃過夜，二抗37℃50min，DAB顯色，蘇木素復染。結果判定:肝細胞胞漿染成棕黃色為陽性。每張切片隨機選取5個高倍視野\\(×400\\)，計數100個細胞中的陽性細胞百分比。
1．2．2．5Western blot檢測ADH1、ALDH2蛋白質的表達提取蛋白并測定蛋白含量。取蛋白質樣品40μg，10%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，分別用ADH1抗體\\(1∶1000\\)、ALDH2抗體\\(1∶1000\\)4℃孵育過夜，二抗\\(1∶3000\\)室溫1h，ECL曝光顯影，GelDocEQ凝膠成像儀掃描，Quantity One軟件分析結果。以β－actin表達水平作為內參照。
1．3統計學方法。采用SPSS16.0統計軟件，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，分析前行方差齊性檢驗，方差齊時兩兩比較采用LSD法，方差不齊時兩兩比較采用Tamhane法。
2、結果
2．1大鼠一般情況A組大鼠皮毛光亮整潔，靈活好動，飲食正常及大小便正常，體重逐漸增加，無死亡現象。B、C組大鼠在灌胃后，輕者步態不穩，動作呆板，重者醉倒嗜睡，翻正反射消失，約2h后逐漸恢復正常;隨著灌胃時間增加，出現不同程度的精神萎靡，活動及飲食減少，皮毛凌亂，光澤度差，大便溏瀉等表現，且癥狀緩解所需時間較長。D、E組大鼠上述表現不明顯，偶見步態不穩，動作呆板現象，但緩解時間較B組均提前。B、C組大鼠由于酒精中毒出現部分死亡現象，B組死亡5只，C組死亡3只;D組由于灌胃不當致食管穿孔死亡1只。
2．2各組大鼠血清ALT、AST活性的比較與A組比較，B、C、D組血清ALT、AST活性明顯升高\\(P＜0.01\\)，E組升高，但差異無統計學意義\\(P＞0.05\\);與B組比較，D、E組明顯降低\\(P＜0.01\\)，C組升高，但差異無統計學意義\\(P＞0.05\\);C組高于D組，D組高于E組，差異有統計學意義\\(P＜0.01\\)。見表1。
2．3各組大鼠血清乙醇、乙醛濃度的比較末次灌胃1h后，與B組比較，C組血清乙醇濃度明顯升高\\(P＜0.01\\)，D組降低，但差異無統計學意義\\(P＞0.05\\)，組明顯降低\\(P＜0.01\\)，C組高于D組，D組高于E組，差異有統計學意義\\(P＜0.01\\);末次灌胃12h后，與B組比較，C組血清乙醇、乙醛濃度明顯升高\\(P＜0.05，P＜0.01\\)，D、E組均明顯降低\\(P＜0.01\\)，C組高于D組，D組高于E組，差異有統計學意義\\(P＜0.01\\)。見表2。
2．4各組大鼠肝組織勻漿SOD、GSH－PX含量的比較與A組比較，B組肝組織勻漿SOD、GSH－PX含量明顯降低\\(P＜0.01\\)，C組降低，但差異無統計學意義\\(P＞0.05\\)，D、E組明顯升高\\(P＜0.05，P＜0.01\\);與B組比較，C、D、E組均明顯升高\\(P＜0.01\\);E組高于D組，D組高于C組，差異有統計學意義\\(P＜0.01\\)。見表3。
2．5各組大鼠肝組織勻漿MDA含量的比較與A組比較，B、C、D組肝組織勻漿MDA含量明顯升高\\(P＜0.01\\)，E組升高，但差異無統計學意義\\(P＞0.05\\)，與B組比較，D、E組明顯降低\\(P＜0.01\\)，C組降低，但差異無統計學意義\\(P＞0.05\\)，C組高于D組，D組高于E組，差異有統計學意義\\(P＜0.01\\)。見表3。
2．6各組大鼠肝組織勻漿ADH含量的比較與A組比較，B、C、D組肝組織勻漿ADH含量明顯降低\\(P＜0.01\\)，E組升高，但差異無統計學意義\\(P＞0.05\\)，與B組比較，C組降低，D組升高，但差異均無統計學意義\\(P＞0.05\\)，E組明顯升高\\(P＜0.01\\)，E組高于D組，D組高于C組，差異有統計學意義\\(P＜0.01\\)。見表3。
2．7各組大鼠肝組織勻漿ALDH含量的比較與A組比較，B、C、D、E組肝組織勻漿ALDH含量均明顯降低\\(P＜0.01\\)，與B組比較，C、D、E組明顯升高\\(P＜0.01\\)，E組高于D組，D組高于C組，差異有統計學意義\\(P＜0.01\\)，見表3。
2．8各組大鼠肝組織ADH1mRNA和蛋白質表達的比較與A組比較，B、C、D組肝組織ADH1mRNA和蛋白質表達明顯降低\\(P＜0.01\\)，E組升高，但差異無統計學意義\\(P＞0.05\\);與B組比較，C組降低，D組升高，但差異無統計學意義\\(P＞0.05\\)，E組明顯升高\\(P＜0.01\\)，E組高于D組，D組高于C組，差異有統計學意義\\(P＜0.01\\)。見表4和圖1、2。
2．9各組大鼠肝組織ALDH2mRNA和蛋白質表達的比較與A組比較，B、C、D、E組肝組織ALDH2mRNA和蛋白質表達明顯降低\\(P＜0.01\\);與B組比較，C、D、E組均明顯升高\\(P＜0.01\\)，E組高于D組，D組高于C組，差異有統計學意義\\(P＜0.01\\)，見表5和圖3、4。
3、討論
酒是人們日常生活及社交活動中常見飲品，但人體在大量飲酒后通常易出現口干舌燥、頭昏腦漲、心跳加速、血壓上升等癥狀，所表現出的癥狀及輕重程度在飲用不同酒質后不盡相同，部分品牌白酒造成的不適感相對較少。而造成上述癥狀的主要原因，是酒中所含的乙醇在體內代謝過程中生成的乙醛所致。
乙醇進入體內后通過胃腸道吸收，經胃腸消化器官后的乙醇約有90%在肝臟中被代謝，乙醇在肝臟中的代謝有3條途徑，其中以位于線粒體中的ADH系統較為常見，此途徑中乙醇經ADH氧化為乙醛，乙醛經線粒體中的ALDH氧化為乙酸，乙酸再經三羧酸循環，最終氧化成二氧化碳和水。但因乙醛轉化為乙酸的速度較慢，易導致乙醛在體內蓄積。乙醛可與肝細胞中的蛋白質、DNA發生整合，形成乙醛加合物，如MDA－乙醛加合物、α－羥乙基蛋白－乙醛加合物等，諸多乙醛加合物可導致受其影響的蛋白質發生變構，失去應有的功能，從而引起肝細胞功能受損，甚至削弱DNA自身修復，誘導姐妹染色體單體互換，導致DNA突變或畸形，進而使肝細胞異常增殖，最終引起肝硬化甚至肝癌。同時，乙醛加合物還能使機體活性氧增多，氧化應激水平升高，導致脂質過氧化，MDA升高，某些抗氧化物質如SOD、GSH－PX大量消耗，削弱機體多個器官特別是肝臟的抗氧化能力，其誘導的氧化應激作用在酒精性肝病發生發展過程中扮演著重要角色。
乙醛對肝細胞的毒性作用取決于肝細胞暴露于乙醛的程度，同時取決于乙醇是否由ADH迅速轉化為乙醛，并由ALDH迅速轉化為無毒的乙酸?？梢?，在乙醇代謝解毒過程中，ADH和ALDH發揮著至關重要的作用，是乙醇代謝的關鍵限速酶。ADH及ALDH均具有基因多態性，人體ADH有8種同工酶，其中主要是ADH1參與乙醇轉化為乙醛的過程，尤其以ADH1B*2催化效率最高。ALDH有4種同工酶，主要是AL-DH2參與乙醛轉化為乙酸的過程，尤其以ALDH2*1催化效率最高。因此，本實驗選擇檢測大鼠肝組織ADH1及ALDH2的表達。
本研究發現，實驗用白酒對大鼠肝功能的損傷較乙醇低，主要表現為中、低劑量白酒對血清ALT、AST影響較小，且3種不同劑量的白酒對大鼠SOD、GSH－PX的誘導表達均明顯高于乙醇，而對MDA的誘導低于乙醇，說明實驗用白酒對提高肝臟對抗氧化應激及脂質過氧化的能力具有一定功效。
高、中劑量白酒對大鼠ADH的表達影響與乙醇差異不明顯，僅低劑量組大鼠ADH較乙醇組明顯升高，表明實驗用白酒與乙醇對大鼠ADH的影響不存在明顯差異。而其對ALDH的影響與乙醇存在著明顯差異，白酒高、中、低劑量組大鼠ALDH的表達均明顯高于乙醇組，同時，白酒中、低劑量組末次灌胃12h后的血乙醇、乙醛濃度明顯低于乙醇組，說明該白酒能增加ALDH活性，從而加速乙醛的生物學轉化過程，能更迅速使乙醛轉化為對機體無害的乙酸、二氧化碳及水，從而減輕乙醛蓄積對機體造成的傷害。
某些醬香型白酒的釀造工藝獨具特色，經過多年的貯藏以及勾兌后再貯存一段時間，在自然老熟過程中極大地降低了醛類、苯、硫化物等各種對人體有害的物質，兼之實行敞開釀造，空氣中有大量在獨特地理環境下形成的有益微生物可供吸納，故其風格獨樹一幟，除乙醇外，其內還含有多種氨基酸、維生素、SOD及多種人體必需微量元素，不能等同于乙醇，因而其對肝臟的作用與乙醇單獨對肝臟的作用可能有所不同。以往的研究曾對99名貴州茅臺酒廠長期大量飲用茅臺酒的職工進行流行病學調查，發現長期飲用茅臺酒可致脂肪肝，不引起明顯肝纖維化及肝硬化，其后的基礎研究表明，茅臺酒能誘導肝臟金屬硫蛋白及血色素加氧酶－1的基因表達增加及肝臟金屬硫蛋白含量增加，從而抑制與肝纖維化密切相關的星狀細胞的活化及膠原蛋白生成;經處理去掉乙醇后的茅臺液可減輕酒精所致的氧化應激反應，增加肝臟的脂質抗氧化作用。因此，其有異于乙醇的獨特品質決定了其對肝臟ADH、ALDH的影響可能有所不同。
本實驗同時也發現，無論是對大鼠血清ALT、AST、乙醇、乙醛，還是對肝組織勻漿SOD、GSH－PX、MDA、ADH、ALDH及肝組織ADH1、ALDH2mRNA和蛋白質表達的影響，白酒高、中、低劑量組之間差異均有統計學意義，表明隨著飲酒量增加，其對機體造成的不良影響也會增加，與文獻報道一致。因此，飲酒應適度，切忌過量。
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