納米二氧化鈦\\(粒徑＜100nm\\)具有超微性，紫外吸收性和高效光催化活性三大特性，這些特性與它的生物學特性密切相關。隨著納米二氧化鈦在生活生產中的廣泛運用，人們不可避免的接觸到含納米二氧化鈦的物品，納米二氧化鈦可以通過吸入、攝食、皮膚滲透和注射等途徑進入機體，過去的一段時間認為它是沒有毒性的，并作為陰性對照進行粉塵的體內和體外研究。納米級的顆粒通過吸入途經進入機體后，不同粒徑的顆粒沉積在肺的不同位置，肺泡的巨噬細胞具有識別清除抗原性異物，參與和促進炎癥反應過程，對腫瘤和病毒感染等靶細胞的殺傷作用，專職的抗原提呈細胞，啟動特異性免疫應答和免疫調節等作用。
TiO2-NPs通過呼吸道進入體內首先與肺泡巨噬細胞接觸，從而可能產生各種健康效應。凋亡指的是細胞在受到刺激之后啟動的程序性死亡，是細胞產生的一種保護性措施。該研究以大鼠肺泡巨噬細胞NR8383作為研究對象，探討不同粒徑的二氧化鈦納米顆粒對巨噬細胞凋亡的影響。
1、材料與方法
1.1主要材料NR8383大鼠肺泡巨噬細胞由中山大學饋贈。二氧化鈦納米顆粒\\(TiO2-NPs\\)，共四種粒徑:\\(10±1.5\\)nm、\\(30±3\\)nm、\\(50±3\\)nm、\\(100±5\\)nm，純度為99.9%，購買于北京納辰科技發展有限責任公司;CCK-8檢測試劑盒，Hoechst33258染色液，抗熒光猝滅封片液，碘化丙啶\\(PI\\)染色液均購自碧云天;F12K培養基購自北京邁晨科技;胎牛血清購自Gibco;青鏈霉素，HEPES購自北京索萊寶，多聚甲醛購自上海生工。
1.2方法
1.2.1細胞培養:NR8383細胞培養于含20%FBS\\(55℃滅活30min\\)，1%青鏈霉素，1%HEPES的F12K培養基，37℃5%CO2條件下培養。
1.2.2二氧化鈦納米顆粒懸液制備:稱取不同粒徑TiO2-NPs50mg，分別溶于PBS，用電磁攪拌器初步混懸之后，并定容至100ml，超聲振蕩2h，制成500μg/mlTiO2-NPs儲備染毒懸液，高壓滅菌備用。使用前，超聲振蕩20min，將儲備染毒懸液用F12K培養基逐級稀釋成實驗所需濃度使用。
1.2.3細胞活力\\(CCK-8法\\):將NR8383細胞以5×104個/孔，密度接種于96孔板，設三個復孔，在37℃5%CO2條件下培養24h，分別加入等體積的濃度為0.2、1、5、25μg/ml的TiO2-NPs處理NR8383細胞，48h后，每孔加入10μlCCK-8試劑，37℃5%CO2繼續培養3h后用酶標儀450nm波長下檢測各組細胞OD值，630nm為參考波長，進行細胞比活力分析，正常細胞為對照組，培養基組為空白調零孔。
活力比\\(%\\)=\\(實驗孔OD值－調零孔OD值\\)/\\(對照孔OD值－調零孔OD值\\)×100%1.2.4核形態\\(Hoechst33258染色\\):選取濃度為25μg/mlTiO2-NPs處理NR8383細胞48h后，離心收集細胞，PBS洗一次，重懸細胞，滴至干凈載玻片上，盡量使細胞分別均勻，稍晾干，4%多聚甲醛避光固定15min，去多聚甲醛后，滴加Hoechst33258染色液覆蓋細胞，避光染色5min，去染色液后滴加抗熒光猝滅封片液，蓋上蓋玻片于熒光倒置顯微鏡下觀察，未經TiO2-NPs處理組為對照組。
1.2.5細胞周期及凋亡實驗\\(PI染色\\):各濃度1、5、25μg/ml組TiO2-NPs處理NR8383細胞48h后，離心收集細胞，預冷PBS洗一次，加入1ml冰浴預冷75%乙醇中，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。每管細胞樣品中加入0.5ml碘化丙啶\\(PI\\)染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37℃避光溫浴30min，流式細胞儀檢測。
1.3統計學方法。實驗數據采用統計軟件SPSS18.0進行統計分析，均數比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，P＜0.05認為差異有統計學意義。
2、結果
2.1細胞活力分析結果。如圖1示，不同濃度不同粒徑TiO2-NPs作用48h后，NR8383細胞活力在同一粒徑下隨濃度增加而增加，同一濃度下隨粒徑增加而降低，粒徑為10nm，25μg/ml時細胞活力最大，設正常對照組細胞活力為100%。
2.2Hoechst33258染色。如圖2示，經Hoechst33258染色后熒光倒置顯微鏡下可見發生凋亡的細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，正常細胞核常呈現圓形，淡藍色，內有較深藍色顆粒。吞噬較高濃度TiO2-NPs后的細胞核被擠壓到邊緣，外周能見到吞入到巨噬細胞內部的模糊的納米顆粒陰影邊緣。從結果可以看出熒光著色致密的細胞核數量增加。
2.3細胞周期及凋亡實驗。如圖3示，不同濃度不同粒徑TiO2-NPs作用48h后，NR8383細胞出現不同程度的凋亡。隨粒徑大小增加凋亡率增加，隨濃度增加凋亡率也隨之增加。粒徑100nm，25μg/ml時，凋亡率最大，與對照組凋亡率比較均差異有統計學意義。
3、討論
3.1細胞發生凋亡時，形態發生改變。細胞膜和細胞器保持相對完整，細胞整體皺縮，細胞核固縮，能被核染料如Hoechst33258等染色并呈現濃染，這些現象與細胞壞死時的細胞膜細胞器等結構溶解、破壞完全不同。細胞凋亡分為兩條途徑:一是細胞外的死亡受體途徑，另一條是細胞內的線粒體途徑。死亡受體途徑主要是通過激活細胞內的P53，Fas，Bcl-2，NF-κB等凋亡相關基因，由腫瘤壞死因子\\(TNF\\)受體家族介導，從而進一步激活Caspase-8。線粒體途徑是通過改變細胞線粒體的膜電位，細胞色素C釋放，細胞內Ca2+濃度升高，pH值下降，導致Caspase-9激活。兩個途徑都導致效應性Caspase-3活化。
3.2巨噬細胞是機體內吞噬外來物質的第一道防線，是機體重要的防御屏障。通過呼吸道進入機體的顆粒，因粒徑不同，沉積在呼吸道的不同位置，對機體造成的影響也不一樣。粒徑＜2.5μm的細顆粒物稱為PM2.5。與較粗的大氣顆粒物相比，PM2.5粒徑小，比面積大，活性強，且在大氣環境中的停留時間長、輸送距離遠，因而對人體健康和大氣環境質量的影響更大。跟PM2.5相比，納米顆粒的粒徑更小，比面積更大，對人體健康和大氣環境質量的影響可能會更大，所以探索納米顆粒不同粒徑不同濃度進入呼吸道后，對機體組織細胞產生的影響研究是必要的。
3.3有研究表明TiO2-NPs能引起細胞的凋亡。TiO2-NPs刺激大鼠肺泡巨噬細胞之后，能引起細胞的凋亡，對細胞造成一定的損傷，這種效應隨TiO2-NPs的粒徑和濃度變化。該研究結果也證實了這個結論，通過實驗結果分析發現，不同粒徑TiO2-NPs刺激48h后，大鼠肺泡巨噬細胞NR8383細胞活力反而增加，這可能是NR8383細胞在受到外源物刺激之后，識別并吞噬外源物，巨噬細胞增殖以便消除外來物，但是TiO2-NPs被內吞之后并不能被NR8383細胞消化最終消除。TiO2-NPs刺激48h后NR8383細胞伴隨有凋亡現象，凋亡程度隨粒徑和濃度變化。隨著TiO2-NPs粒徑10、30、50、100nmNR8383細胞凋亡增加，隨濃度0.2、1、5、25μg/mlNR8383細胞凋亡增加。
Kennedy，應杏秋，閆慶倩等的研究可以得知同一種物質顆粒粒徑越小越容易進入細胞內。TiO2-NPs被內吞進入巨噬細胞之后，對細胞造成的損傷可能與抗氧化機制和炎癥反應有關系。實驗證明巨噬細胞內吞TiO2-NPs之后，相關轉錄因子NF-κB表達增加，它編碼許多與炎癥相關的炎癥介質如TNF-α，IL-1b，和MIP-2等。NF-κB是核轉錄因子，它調控細胞的多種生理功能。在凋亡的死亡受體途徑中，NF-κB在TNF，IL等的刺激下啟動并調控凋亡。綜合以上實驗結果，NR8383細胞受到TiO2-NPs刺激后能產生凋亡，結合其他研究者的研究結果發現，這可能與NF-κB的調控作用有密切關系，具體的機制在今后的研究中還有待進一步深入的探究。
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