鼻咽癌\\( NPC\\) 是一種惡性上皮腫瘤，具有顯著的地域性和種族性。在我國廣東省，鼻咽癌的發病率居于世界首位，每年平均 10 萬人中就有 30 ～ 80 例患病。目前多采用放射性治療鼻咽癌，但癌細胞的輻射抗性可導致治療失敗，腫瘤局部失控或復發。因此，如何逆轉腫瘤的輻射抗性是鼻咽癌治療所面臨的新問題。
細胞角蛋白\\( Cytokeratins\\) 因在組織發生惡變后會出現差異性表達，被廣泛應用于腫瘤的診斷。其中，角蛋白 13\\( Keratin-13，KRT13\\)已經在各 種 癌 癥 中 發 現，同 時 有 研 究 認 為它與細胞的放射敏感性有關。本研究首次構建反義 KRT13 慢病毒質粒，篩選出穩定轉染該慢病毒的鼻咽癌細胞株 anti-KRT13-HNE-1，并進一步探討反義 KRT13 質粒對鼻咽癌細胞株放射敏感性的影響，為鼻咽癌新的基因 － 放射聯合治療提供理論基礎。
1 材料與方法
1 ． 1 實驗材料人鼻咽癌高分化鱗癌細胞株 HNE-1 由湘雅醫學院腫瘤中心提供。pLV-EGFP 慢病毒載體及包裝系統購自北京英茂盛業生物科技有限公司。pUC57-KRT13 由本科室構建。G418和 PI 購自美國 Sigma 公司。Trizol 購自 Invitro-gen 公司 。 cDNA 第一 鏈 合 成 試 劑 盒 和 熒 光 定量 PCR 試 劑 盒 均 購 自 北 京 天 根 生 化 公 司。
KRT1 3 和 β -actin 小 鼠 一 抗 、HRP 標 記 羊 抗 小鼠二抗均購自美國 Santa Cruz 公司。RIPA 裂解液、ECL 化學發光試劑盒和 Annexin V-FITC / PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天公司。
1 ． 2 細胞培養人鼻咽癌高分化鱗癌細胞株 HNE-1 用含1 0 % 胎 牛 血 清 的 RPMI 1 6 4 0 培 養 基 ，置 于3 7 ℃ 、5 % CO2飽和濕度培養箱內培養。
1 ． 3 質 粒構建反義 KRT13 設計的帶有酶切位點引物，上游: \\( BamHI \\) GGATCCGCACCTGCTCTCAAT，下游: \\( AplI \\) GGGCCCAACCCCCACCAAAGCCA，采用 PCR 法從已有的質粒模板 pUC57-KRT13 中擴增出所要的片段，隨后用 BamHI 和 AplI 雙酶切并回收，用 T4 連接酶與 pLV-EGFP 慢病毒質粒反向連接過夜得到連接產物。根據 pLV-EG-FP 慢病毒包裝系統說明書進行操作 。
1 ． 4 細胞感染及篩選穩定表達反義 KRT1 3 細胞系PBS 稀釋上清 ，并依照文獻測定病毒滴度。將病毒依照滴度測定的量感染 HNE-1 細胞 3 次，并定期在熒光顯微鏡下觀察，當細胞均出現綠色熒光后即得到穩定的細胞株用于后續實驗。
1 ． 5 各組細胞中 KRT1 3 的檢測按數 字 隨 機 法 將 細 胞 分 為 control \\( 正 常HEN -1 細胞 \\) 組 、lentivirus \\( 轉染慢病毒空載體 \\)組和 anti-KRT13 \\( 轉染慢病毒質粒組\\) ，以 Tr-izol 法提取總 RNA ，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，取 2 μl mRNA 使用 cDNA 逆轉錄試劑盒合成 cDNA 第一鏈，按照熒光定量試劑盒說明對各組細胞的 cDNA 進行相對定量檢測。擴增條件: 變 性 95℃ 2 min; 95℃ 15 s，60℃ 30 s\\( 35 個循環\\) ; 溶解曲線階段依照儀器說明設定。結果采用 2-ΔΔCt 方法進行 mRNA 表達差異分析。
收集各組對數生長期細胞，RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA 法進行定量檢測。聚丙烯酰胺 凝 膠 電 泳 \\( SDS-PAGE \\) 后 將 蛋 白 轉 移 至PVDF 膜上 ，5 % 脫脂奶粉封閉 1 h ，加入小鼠一抗后 4℃ 過 夜 孵 育，TBST 洗 膜 3 次 \\( 5 min /次\\) ，加入稀釋的 HRP 標 記 羊 抗 小 鼠 二 抗，室溫孵育 2 h; TBST 洗膜 3 次\\( 5 min / 次\\) 后，進行化學發光檢測。β-actin 作為內參進行 進 一步處理。
1 ． 6 細胞輻射選取指數生長期細胞，經 0． 25% 胰酶消化制成單細胞懸液，計數細胞濃度，按預定數量接種于 6 孔板中，置于培養箱中孵育 12 h 后，采用 Varian 2300 EX 直線加速器 6MV-X 線照射，劑量率 400 cGy / min，垂直輻射細胞，細胞上面覆蓋 1 cm 有機玻璃填充物幫助劑量建成，固定源皮距 SSD 100 cm，照射野面積 10 cm ×1 0 cm 。
1 ． 7 細胞周期實驗指數生長期細胞經 2 Gy 照射 24 h 后進行收集，加入 70% 冰 乙 醇 中 4℃ 過 夜，PBS 洗 滌3 遍后 ，避 光 將 細 胞 加 入 到 含 有 5 0 μg / ml 的RNA 酶 和 50 μl / ml PI 染 色 液 中 ，室 溫 孵 育30 min 后 ，流式細胞儀檢測細胞周期各時相所占比例。
1 ． 8 細胞凋亡檢測指數生長期細胞經 2 Gy 照射 24 h 后，胰酶消化并用 PBS 洗滌 3 遍，重懸細胞離心后棄上清，加入 190 μl Annexin V-FITC 溶液輕輕重懸細胞，室溫孵育 10 min 后，再加入 5 μl 碘化丙丁\\( PI\\) 染色液，輕輕混勻。冰浴避光放置。隨即進行流式細胞術檢測。
1 ． 9 克隆形成實驗3 組細胞按預定數量接種于 6 孔板中 ，每組均設 0、1、2、4、6、8 Gy 6 個劑量組，每一劑量組 3 個復孔。照射后的細胞置于 37℃ 、5%CO2培養箱內培養。當出現肉眼可見克隆時，終止培養，2 ml 甲醇固定 15 min，4% 吉姆薩溶液染色 10 ～ 30 min，去染色液，自然干燥。顯微鏡下計數含 50 個細胞以上的克隆數，計算克隆形成率\\( planting efficiency，PE，克隆形成率= 克 隆 數 / 接 種 細 胞 數 × 1 0 0 % \\) 和 存 活 分 數\\( surviving fraction，SF，存活分數 = 受照射細胞的克 隆 形 成 率 / 對 照 細 胞 的 克 隆 形 成 率 ×1 0 0 % \\) 。 以 3 次照射的存活分數均值進行分析，運用 GraphPad Prism 6． 0 軟件進行多靶單擊模型和線性二次模型曲線擬合，繪制劑量存活曲線，并計算多靶單擊模型參數 D0、Dq、和 N和線性二次模型參數 α、β、α / β、SF2 \\( survivalfractionat 2 Gy \\) 。
1 ． 1 0 統計學分析采用 SPSS 16． 0 軟件進行統計分析，實驗數據以 x珋 ± s 表示，各組間的比較采用單因素方差分 析 \\( One-way ANOVA\\) 或 獨 立 樣 本 的 t 檢驗，以 P ＜ 0． 05為差異具有統計學意義。
2 結果
2 ． 1 質粒構建 、感染及穩篩細胞系的建立構建含有 KRT13 反 義 序 列 的 慢 病 毒 質 粒經測序比對確認正確后，共轉染 293FT 細胞得到含有慢病毒的上清液，測定滴度后感染 HNE-1 細胞，經過 G418 篩選后得到穩篩細胞系 。
2 ． 2 反義 KRT1 3 鼻咽癌細胞株的鑒定RT -qPCR 檢測 3 組細胞中 KRT1 3 的 mRNA表達水平，結果\\( 圖 1A\\) 顯示: 與正常細胞組相比，空載體組為正常細胞組的 1． 011，無明顯差異\\( P ＞ 0． 05\\) ; 質粒組為正常細胞組的0．284，表達明顯降低\\( P ＜ 0．001\\) 。Western blot 的檢測結果從蛋白水平上確證了這一結果\\( 圖1B\\) ?！緢D1】
2 ． 3 細胞周期和凋亡檢測流式細胞儀分析結果表明\\( 圖 2、3\\) ，照射前正常細胞組、空載體組、質粒組的細胞周期圖 1 反 義 KRT13 慢 病 毒 質 粒 對 HNE-1 細 胞 內KRT1 3 表達量的影響 A : Realtime PCR 檢測各組細胞中 KRT13 的 mRNA 表達情況; B: Western blot 檢測各組細胞 KRT13 蛋白表達情況中，G0 / G1 以及 S 期均無顯著性差異，但 G2 / M期細胞比例略有差別，分別為\\( 10．67 ±0．91\\) % 、\\( 10． 74 ± 0． 24 \\) % 和 \\( 13． 04 ± 0．80 \\) % \\( P =0． 123 \\) 。照射 2 Gy 24 h 后，G2 期細胞比例均顯著升 高，分 別 為 \\( 29． 42 ± 1．75\\) % 、\\( 28． 74 ±1． 07 \\) % 和 \\( 39 ． 20 ± 1． 40 \\) % ，3 組細胞均出現G2 / M 期阻滯，且質粒組更為明顯 ，與其他組相比差異具有統 計 學 意 義 \\( P 均 ＜ 0． 05 \\) ，說 明KRT1 3 沉默后顯著增加了輻射引起的細胞 G2期阻滯。此外，細胞凋亡分析 結 果 表 明，2 Gy照 射 24 h 后，質 粒 組 細 胞 凋 亡 率 \\( 8． 74 ±0． 80 \\) % 較正常細胞組 \\( 2 1 ． 4 5 ± 0 ． 4 9 \\) % 及空載體組\\( 21． 46 ± 0． 64 \\) % 的細胞凋亡率下降，差異具有統計學意義\\( P ＜ 0． 05\\) ?！緢D2-3】
2 ． 4 KRT1 3 沉 默 后 降 低 鼻 咽 癌 HNE -1 細 胞體外放療敏感性3 組細胞經過 X 射線照射后 ，依據各劑量組克 隆 數 計 算 出 克 隆 形 成 率 和 存 活 分 數\\( 圖 4\\) ，并應用 GraphPad Prism 6． 0 軟件進行曲線擬合，繪制出存活曲線\\( 圖 5、6 \\) ，求出多靶單擊模型及線性二次模型各放射生物學參數，并統計分析\\( 表 1\\) ?！颈?】
圖 4 結果表明，轉染反義 CK13 組的克隆形成數和形成率明顯大于空載體組和正常細胞組，且差異具有統計學意義\\( P ＜ 0． 05\\) 。圖 5、6 結果表明，X 線照射后，正常細胞組和空載體組的各組放射生物學參數均相似，說明兩組細胞的放射敏感性無顯 著 性 變 化。而在相同放射劑量下，與空載體組和正常細胞組相比，轉染反義 CK13 基因后的細胞存活分數升高，可以看出，轉染反義 CK13 基因后，D0、Dq 、SF2 均 增 加 ，α 值 、α / β 均 減 小 。 說 明CK1 3 基因的沉默減低了 HNE1 細胞的放射敏感性\\( 表 1\\) ?！緢D4略.圖5-6】
3 討 論
KRT1 3 基因是非角化復層鱗狀上皮細胞分化的標 志，KRT13 與 KRT4 結 合 在 一 起，形 成絕大 多 數 腔 內 復 層 鱗 狀 上 皮 的 主 要 角 蛋 白網，通常 KRT13 基因只表達在非角化復 層鱗狀上皮的淺層，如鼻咽、舌、食管及泌尿系統上皮等，但這些部位的腫瘤 KRT13 基因多表達異常，邱元正等采用免疫組化及 North-ern -blot 方法檢查 發 現 ，鼻 咽 癌 中 KRT1 3 表 達下調; 王 亞 利 等采 用 芯 片 分 析 發 現 鼻 咽 癌CNE -2 細胞骨架相關蛋白中 ，KRT1 3 基因表達下調，他們認為放射線改變了細胞形態，影響細胞的信息傳遞，改變腫瘤細胞的穩定性，從而改變了細胞的放射敏感性。這 提 示 我 們 在分子靶向治療尚無法完全取代放化療等經典治療方 法 之 時，充 分 利 用 這 種 協 同 和 增 敏 作用，實現提高放療療效與減少副作用，將更具臨床應用意義。
目前，鼻咽癌公認和有效的治療方法為放射治療或以放療為主的綜合治 療。盡 管 很 多研究表明反義寡核苷酸和 RNAi 干擾對鼻咽癌細胞放射敏感性具有一定影響，但是由于其在體內運送過程中易被降解限制了二者的應用。
反義核 酸 作 為 基 因 治 療 藥 物，具 有 高 度 特 異性、高效性、低毒安全等優點，是一種優化的藥物設計。采用慢病毒作為載體可 感 染 非 分 裂期細 胞，實 現 細 胞 的 穩 定 表 達，可 容 納 復 雜DNA ，是相對理想的基因治療載體。
本研究首次 嘗 試 以 KRT13 基 因 中 合 理 的反義 序 列 為 對 象，成 功 構 建 慢 病 毒 載 體，將KRT1 3 的 反 義 RNA 導 入 鼻 咽 癌 HNE -1 細 胞中，通過 G418 篩選出穩定表達反義 KRT13 片段的 鼻 咽 癌 HNE-1 細 胞。RT-PCR 和 Westernblot 檢測結果也證實了該細 胞 中 KRT1 3 的 表達明顯下調。我們進一步采用克 隆 形 成 實 驗及曲線擬合分析了反義 KRT13 鼻咽癌HNE-1細胞的輻射敏感性。D0 值 愈 大，細 胞 對 放 射 愈抗拒; Dq 反映亞致死性損傷修復能力的大小，Dq 值小則修復能力弱 ; α 值決定低劑量照射下損傷的程度，α 值越大，說明細 胞 對 輻 射 越 敏感，β 值的貢獻隨照射劑量增 大 而 增 大，組 織的 α / β 值 高，對 損 傷 修 復 能 力 弱。研 究 結果顯示，與正常細胞組和轉染空載體組相比，轉染質粒組的 SF2 值明顯增加，放射增敏比為1 ． 4 0 1 4 ，D0 、Dq 值 均 明 顯 偏 高 ，P 值 分 別 為0． 002 和 0 ． 0 0 3 ，α / β 值顯著降低 ，說明 KRT1 3沉默后細胞對放射損傷的修復能力增強，反而降低了 HNE-1 細胞的放射敏感性。這從另一個方向證明了 KRT13 的調控可以影響鼻咽癌細胞的放射敏感性。
為進一步研 究 KRT13 影 響 放 療 敏 感 性 的可能機制，我們采用流式細胞儀對照射前后的細胞周期和細胞凋亡變化進行 了 檢 測。本 研究結果顯示 HNE-1 細胞在輻射 24 h 后均出現G2 / M 期阻滯 ，但轉染質粒組 G2 / M 期較正常細胞 組 顯 著 升 高。 輻 射 可 以 引 起 腫 瘤 細 胞DNA 的損傷 ，常常導致細胞阻滯在 G1 期或 G2期進行修復，以防止細胞進入下一個周期復制受損的 DNA 或進行異常分裂。
盡管很多研究表明角蛋白的特異性表達是一些癌癥的標志，但是角蛋白如何影響腫瘤的發生尚不明確。有報道表明角蛋 白 在 癌 癥 中的異常表達常與 AKT / mTOR 有關，此通路本身常在浸潤性腫瘤中被激活，提高了部分角蛋白介導的 AKT 在上皮腫瘤發生中有重要作用的可能性。角蛋白還與 PKC 有相互作用，最近的研究表明，一些角蛋白的分化特異性可能涉及到了 PKC / AP-1 信號通路。此外，降低NOTCH1 的 表 達 也 會 調 控 KRT1 3 的 表 達 下調。這些都表明了角蛋白在細胞中作為分子伴侶的支架重要作用。
本研究結果 說 明 KRT13 可 能 是 一 個 鼻 咽癌輻 射 敏 感 性 相 關 的 調 控 因 子，轉 染 反 義KRT1 3 慢病毒降低了鼻咽癌細胞株 HNE -1 的輻射敏感性。這從另個一側面為 鼻 咽 癌 新 的基因 － 放射聯合治療提供了理 論 基 礎。下 一步我們將在動物模型驗證反義 KRT13 的鼻咽癌 HNE-1 細胞株對輻射敏感性的影響，同時對KRT1 3 的作用分子機理進行深入研究 ，希望能為臨床應用及靶向治療帶來新的思路。
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