對氧磷酯酶\\(Paraoxonase,PON\\)是一類鈣依賴性的催化水解磷酸酯鍵的芳香酯酶,因其常見底物為對氧磷而命名。其包括PON1、PON2和PON3三種亞型,其中PON1主要由肝臟合成分泌入血、高親和結合于高密度脂蛋白\\(high density lipoprotein,HDL\\),是HDL發揮抗氧化及抗炎的主要成分。

大量流行病學調查表明,人群中可因PON1基因多態性、衰老、冠心病、糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病因素出現血清PON1活性降低,我們前期的調研也認為,血清低PON1活性可作為評估冠心病事件發生及嚴重程度的一種危險標志。一系列實驗研究 也 證 實,PON1具 有 抗 動 脈 粥 樣 硬 化 的 作用:PON1基 因 敲 除 \\(PON1 gene knockout,PON1-/-\\)小鼠可觀察到體內HDL更容易氧化,低密度脂蛋白\\(low density lipoprotein,LDL\\)氧化明顯增加,高脂條件下更易導致動脈粥樣斑塊形成;在apoE基因敲除小鼠中高表達PON1,HDL抗氧化能力增強,可有效減緩粥樣斑塊的發展;細胞實驗也發現,PON1轉基因或高表達可降低巨噬細胞過氧化物水 平,顯 著 抑 制 炎 癥 因 子 腫 瘤 壞 死 因 子α\\(tumor necrosis factor-α,TNF-α\\)和白細胞介素-6\\(interleukin-6,IL-6\\)的合成和分泌,明顯改善巨噬細胞的炎癥氧化狀態。盡管PON1確切的作用底物及相關機制仍未徹底闡明,但其抗炎抗氧化活性顯然對于抗動脈粥樣硬化效應有重要意義。

因此,本研究擬構建含人源性PON1基因的慢病毒載體,旨在真核細胞高效表達分泌PON1,為進一步研究PON1的生理性底物、相關代謝性疾病的發生機制及臨床診治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑人胚腎上皮293T細胞購于武漢大學典型培養物保藏中心;pWPI-GFP慢病毒表達載體受贈于美國South Carolina大學醫學院樊大平博士;來源于人肝cDNA文庫含PON1的pUC載體購于Genecopoeia公司;質粒提取試劑盒購于TIANGEN公司;LB培養基為OXOID公司產品;PCR相關試劑為Takara公司產品;DNA凝膠純化回收試劑盒購于Axygen公司;DMEM培養基、胎牛血清、小牛血清購自Gibco公司;對氧磷 \\(paraox-on\\)、巰基乙酸鹽肉湯\\(thioglycollate broth\\)為Sigma公 司 試 劑;LDL購 于ProSpec-Tany公 司;蛋 白Marker、核酸Marker、磷酸鈣轉染試劑盒源于Pro-mega公司;RIPA裂解液購于碧云天生物技術研究所;PON1抗體、羊抗小鼠IgG為Abcam公司產品;ECL化學顯影液購于Thermo公司;TNF-α、IL-6的酶聯免疫吸附\\(ELISA\\)試劑盒購于eBioscience公司;其它試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 方法1.2.1 pWPI-PON1重組載體的構建根據慢病毒載體圖譜及購買的pUC19質粒中PON1序列,設計定點突變PCR的特異寡核苷酸引物,即于目的基因的5′端 添 加 上PmeⅠ酶 切 位 點,上 游 引 物5′-TACGTTTAAACTCCCCGACCATGGCGAAG-3′,下游 引 物5′-GGCGGCGTTTAAACTTAGAG CT-CACA GTAA-3′\\(下劃線標記處為Pme Ⅰ酶切位點\\),引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

PCR擴增長度為1 068bp。PCR條件\\(95 ℃變性,55 ℃退火,72℃延伸\\)PCR反應后,產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統觀察DNA條帶位置。

用限制性內切酶PmeⅠ分別對PON1擴增產物及pWPI-GFP慢病毒載體進行酶切\\(37 ℃水浴4h\\),并將酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分離,采用凝膠純化回收試劑盒純化酶切產物,進而在T4連接酶作用下于16℃連接過夜。次日,連接液轉化感受態細 菌DH5α,鋪 于 含 氨 芐 青 霉 素 \\(ampicillin,Amp\\)的LB培養平板上過夜培養,第2天可挑取單菌落接種于小量含Amp的LB液體培養基中,振搖過夜,收集菌體進行質粒小量提取及瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組子;純化重組質粒送上海桑尼生物科技有限公司進行DNA測序,確證插入目的序列的正確方向,無堿基突變。

1.2.2 pWPI-PON1重組載體轉染293T細胞將對數生長期的293T細胞接種于直徑10cm的細胞培養皿,給予10%胎牛血清的DMEM培養基,在37℃、5% CO2培養箱內培養,待密度至40%-50%且細胞生長狀態良好時進行轉染,轉染前2h細胞換液\\(全培養基\\)。在兩個無菌圓底試管中分別用500μl溶液準備預混的磷酸鈣轉染體系:管1含20μg DNA、62μl 2mol/L CaCl2;管2為2×HEPES緩沖液\\(pH 7.1\\),將管1溶液逐滴加入管2并渦旋震蕩,室溫孵育20min后,逐滴加入293T細胞培養板并混勻,12h后更換新的10%胎牛血清的DMEM培養液,分別于0,12,24,36,48及60h時間點用倒置熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光表達情況,并收取0.2ml培養基,用于測培養基中PON1含量和活性。

1.2.3 Western blotting檢測培養基中PON1的含量不同時間點收集的培養基加5×凝膠上樣緩沖液處理,取35μl進行10% SDS-PAGE分離,將凝膠中 蛋 白 電 轉 移 至 硝 酸 纖 維 素 膜,再 依 次 進 行PON1一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜及ECL化學發光法顯影,以凝膠成像系統掃描分析,檢測樣品中目標蛋白的相對含量。

1.2.4 PON1活性測定將轉染后不同時間點收取的細胞培養液,按本室建立的方法測定PON1活性,即:采用酶水解底物對氧磷為對硝基酚的原理,以100 mmol/L Tris-Cl緩沖液\\(pH 8.5\\)建立200μl的分析體系:含50μl樣品、1.2mmol/L對氧磷、2mmol/L CaCl2、2mol/L NaCl,于25 ℃下,利用酶標儀\\(Eon,Biotek公司\\)在405nm處連續掃描記錄4min內產物生成速率。以每升血清\\(培養基\\)每分鐘生成產物對硝基酚的微摩爾數[μmol/\\(min·L\\)]表示1個PON1酶活性單位值\\(用kU/L表示單位\\)。

1.2.5 小鼠腹腔原代巨噬細胞的培養與氧化模型小鼠腹腔巨噬細胞取材于C57BL/6小鼠\\(購于武漢大學A3動物中心\\),實驗前于小鼠腹腔內注射3%巰基乙酸鹽肉湯3ml,第4天將小鼠安樂死,收集腹腔PBS灌洗液,調整細胞數以1×106/孔鋪于6孔細胞板,以10%小牛血清的DMEM培養液進行原代細胞培養,24h后換為1ml新鮮無血清高糖DMEM培養基,同時加入2ml慢病毒載體瞬時轉染293T細胞48h的培養基,氧化組以10mg/L氧化 型LDL\\(oxidative LDL,ox-LDL\\)[10μmol/LCu2+與LDL 1g/L,37℃共孵育24h,0.2mmol/LETDA\\(pH 7.4\\)終止反應,透析,0.45μm過濾獲得]

處理細胞建立氧化條件,細胞置于37 ℃、5% CO2溫箱繼續孵育,收集6h時各孔的條件培養液及RIPA裂解液處理的細胞,留做炎癥因子的檢測分析。

1.2.6 ELISA法檢測TNF-α、IL-6的水平培養基中TNF-α、IL-6水平的檢測采用ELISA法按試劑盒說明進行,于酶標儀450nm處測量,每個樣本重復3次。每孔細胞以Lowry法測定RIPA裂解液蛋白含量,細胞分泌入培養基中TNF-α、IL-6的含量以單位細胞蛋白量的TNF-α、IL-6水平\\(ng/g細胞蛋白\\)表示。

1.2.7 統計學分析實驗結果以x珔±s表示,采用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析,兩組間均數比較采用t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pWPI-PON1重組慢病毒載體構建與鑒定利用引物 設 計、PCR法 獲 得 兩 端 添 加 酶 切 位 點 的PON1基因,PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳中可見約1kb處有明亮的DNA條帶,與預期PON1條帶基本一致\\(圖1A\\)。

將純化的PCR擴增產物與pWPI載體經酶切連接、轉化后,篩選單菌落進行液體培養、提取質粒,經瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定大小后送檢測序,測序結果證實第1、2號為構建成功的pWPI-PON1重組載體\\(圖1B\\)。

2.2 pWPI-PON1重組體瞬時高效轉染以pWPI-GFP空載體為對照,利用磷酸鈣轉染法將pWPI-PON1重組體轉入293T細胞,轉染換液后于0,12,24,36,48,60h不同時間點在熒光顯微鏡下觀察轉染效率,可見慢病毒的高效轉染率\\(細胞GFP熒光陽性率可達到80%-90%\\),且隨時間延長,GFP蛋白表達量持續增高\\(圖2\\)。

2.3 轉染后培養基中PON1的含量與活性轉染后不同時間點收取細胞培養基,Western blotting檢測結果顯示,與pWPI-GFP轉染對照組比較,pWPI-PON1轉染組可高表達PON1并分泌入培養基中,PON1含 量 在60 h內 呈 時 間 依 賴 性 遞 增 趨 勢\\(圖3\\)。同時采用對氧磷為底物檢測PON1活性,pWPI-GFP轉染組的細胞培養基中幾乎無PON1活性,而pWPI-PON1轉染組培養基中PON1活性隨時間遞增而升高,且在48h可達最高\\(圖4\\)。

2.4 培養基中PON1對巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6的影響采用ELISA法檢測PON1孵育對巨噬細胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-6的影響,結果顯示\\(圖5\\),與基礎對照組相比,含PON1\\(活性為8.3kU/L\\)的培養基與巨噬細胞共孵育6h時,細胞分泌TNF-α、IL-6的水平明顯降低P<0.01\\);在ox-LDL作用下,細胞分泌TNF-α、IL-6的水平顯著上升,而加入含PON1的培養基共孵育,可使細胞TNF-α、IL-6炎癥因子水平降低,差異有顯著性\\(P<0.01\\)。3討論HDL是公認的體內抗動脈粥樣硬化的保護因子,PON1作為HDL特異結合的抗氧化酶成分,已發現其酯酶活性能作用多種底物,如水解LDL的氧化磷脂和血小板活化因子等,可抑制LDL的氧化修飾,純化的PON1可獨立抑制TNF-α誘導的細胞黏附因子1的表達,此作用也可以與HDL結合而加強,故PON1的存在及其抗氧化抗炎活性對于HDL的完整性與功能不可缺少,其在動脈粥樣硬化的發生發展中可能扮演重要角色。

前期有研究利用PON1轉基因鼠來源的巨噬細胞,證實細胞內高表達PON1可發揮其抗氧化抗炎而對動脈粥樣硬化有明顯防御作用。但小鼠腹腔巨噬細胞或骨髓來源的巨噬細胞幾乎不表達PON1。

PON1主要從肝臟合成后分泌入血,因此,為更好闡明循環中PON1對巨噬細胞的影響,我們選擇了慢病毒表達系統,此類重組逆轉錄病毒經不斷完善,可使外源基因長效、穩定表達外源蛋白,有利于代謝性疾病等慢性病研究中的長效動物實驗,已成為基因功能研究和臨床治療最有應用前景的生物工具。本實驗中利用重組慢病毒載體轉染真核293T細胞,獲得了持續高活性PON1的表達分泌,進一步與小鼠腹腔原代巨噬細胞共孵育,模擬了細胞外環境中PON1的作用方式,從而觀察到外源PON1顯著降低細胞炎癥,使其產生TNF-α、IL-6的水平明顯減少。有研究報道,PON1的抗炎作用可通過促使巨噬細胞清道夫受體BI\\(SRBI\\)的高表達,抑制TLR-4活化,下調NF-κB介導的炎癥活化通路;也可能發揮抗凋亡而保護巨噬細胞。另有實驗證明,PON1可通過直接減少炎癥刺激引起的ROS水平,增強HDL抗炎活性。

本實驗中采用熒光顯微鏡觀察到磷酸鈣轉染法可獲得外源蛋白的持續增加,培養基中PON1的活性也隨著升高,說明慢病毒載體對細胞的毒性影響并不顯著。對于60h內,熒光強度和蛋白表達均隨時間而增加,而培養基PON1活性僅在48h時達最高,之后至60h時,活性有所下降,分析此原因,由于細胞轉染60h后一直未換液,細胞代謝產物的積聚可能是導致PON1活性減低的因素,這也從一個側面反映PON1酶活性可受環境、藥物等多因素的調節。因此如何獲得高含量及相應活性的PON1,為后續PON1的作用機制及對疾病干預的研究提供重要信息。

利用慢病毒載體系統表達分泌人的PON1蛋白,為我們深入研究PON1的生理功能、對相關疾病的診療價值提供了多層次、多方位的研究手段,奠定了實驗基礎。