全球有 3． 5 億人感染乙肝病毒\\( hepatitis B virus，HBV\\) ，感染 HBV 是肝臟疾病的主要原因，HBV是肝細胞癌\\( hepatocellular carcinoma，HCC\\) 的致病因子已得到公認。腫瘤的擴散、轉移是惡性腫瘤的主要特征，肝癌細胞的連續增殖和不斷分化是肝癌轉移浸潤的重要原因之一?；|金屬蛋白酶\\( matrixmetalloproteinases，MMP\\) 是一種依賴鋅離子的蛋白酶家族，在腫瘤的轉移浸潤過程中參與細胞外基質的降解。其中 MMP-2 與肝癌的發生發展、轉移浸潤密切相關。HepG2． 2． 15 細胞是含有 HBV 基因的肝癌細胞，是研究 HBV 的細胞模型系統。HBx基 因是HBV病毒基因組中最小的開放性讀碼框，HBx 蛋白是一種多功能蛋白，參與細胞周期與凋亡調控、信號轉導通路、DNA 復制、細胞黏附和肝癌發生等病理過程。有研究顯示肝細胞在表達 HBx 后MMP 的表達也會發生改變，具體機制還有待進一步研究。本實驗應用 ＲNA 干擾技術沉默 HBx 基因，觀察抑制 HBx 基因表達對 HepG2． 2． 15 細胞增殖及MMP-2 表達的影響，初步探討 HBx 基因與肝癌轉移浸潤的相關性。
1 材料和方法
1． 1 材料 肝癌細胞株 HepG2． 2． 15 購自博慧斯生物技術公司; psiHBV/X 與對照質粒 pTZU + 1 由瀘州醫學院張建軍教授惠贈; 質粒擴增菌種 DH5α、內切酶等購于寶生物有限公司; DMEM 高糖培養基、胰蛋白酶為 Gibco 產品; 胎牛血清購于HyClone 公司; LipofectamineTM2000 為 Invitation 公司產品; MMP-2抗體購自 Santa Cruz 公司; PCＲ 引物由 TakaＲa 公司合成。
1． 2 方法
1． 2． 1 實驗分組及質粒轉染 實驗分四組: 以未轉染的細胞作為空白對照組\\( control group\\) ; 僅加脂質體的細胞作為脂質體組\\( LipofectamineTM2000 group\\) ; 以轉染陰性對照質粒細胞作為質粒對照組\\( control plasmid group\\) ; 以轉染 psiHBV/X 質粒細胞作為 psiHBV/X 實驗組\\( psiHBV/X group\\) 。利用脂質體 LipofectamineTM2000 將 pTZU + 1 與 psiHBV / X 質粒轉入細胞\\( 操作步驟同說明書\\) : 選取對數生長期細胞，待細胞匯合度為70%左右時進行轉染，6 h 后更換正常培養基，繼續培養24、48、72 h。
1． 2． 2 ＲT-PCＲ 檢測 HBx 基因的表達 ＲT-PCＲ 分析轉染24 h后各組細胞 HBx 基因的表達情況，HBx 引物為: 上游5'-TCATCGCCAGCATCATCAAAC-3'，下游 3'-ATGTACGGCTG-GAGGTCTGTCA-5'，擴增長度為 463 bp。用 ＲNA 抽提試劑盒分別提取每組細胞總 ＲNA，按試劑盒說明書進行反轉錄反應，以 2 μL ＲT 產物為模板，分別擴增 β-actin 和 HBx 基因片段。擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統掃描，以各組目的基因與內參的吸光度比值作為相對表達量，比較各組之間的差異。
1． 2． 3 MTT 法檢測細胞的增殖 取對數生長期細胞接種于96 孔板中，1 × 104/ 孔。按實驗分組進行細胞轉染，置于 CO2培養箱中培養 24、48、72 h，洗掉培養液，加入不含胎牛血清的培養基 100 μL、50 μL MTT 溶液，繼續培養 4 h，吸掉各孔上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，搖床低速震蕩10 min，預熱酶聯免疫檢測儀 20 min 后，酶標儀 490 nm 波長處測定各孔吸光度值，計算轉染24、48、72 h 細胞增殖情況。
1． 2． 4 Ｒeal-time quantitative PCＲ \\( qＲT-PCＲ \\) 檢 測 MMP-2mＲNA 表達 細胞總 ＲNA 提取同上。取 ＲNA 樣品 2 μL，用98 μL DEPC 處理過的雙蒸水混合于石英比色杯中，以 DEPC 處理過的雙蒸水為空白對照管，在紫外分光光度計上分別測定其260 nm 和 280 nm 處的吸光度\\( A\\) 值。1． 70≤A260/ A280≤2． 2 認為純度符合要求。將 ＲNA 樣品用以 DEPC 處理過的雙蒸水稀釋為50 ng / μL。上反轉錄儀，反轉錄條件為: 37℃ 15 min，85℃ 5 s。取出 cDNA 后進行后續實驗。MMP-2 引物: 上游 5'-CTCATCG-CAGATGCCTGGAA-3'，下游 3'-CAGCCTAGCCAGTCGGATTTG-5'，擴增長度為 167 bp。內參 β-actin 引物: 上游 5'-TGGCACCCAG-CACAATGAA-3'，下游 3'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5'，擴增片段長度232 bp。采用2－ △△Ct法計算 MMP-2 mＲNA 的相對表達量。
1． 2． 5 Western blot 法檢測 MMP-2 蛋白表達 用預冷 PBS 將各組細胞漂洗 2 次，加入 1 mL 蛋白裂解液充分裂解，4℃，12 000 r / min離心 5 min，上清即為蛋白提取物。按 BCA 蛋白含量檢測試劑盒步驟制作標準曲線，計算樣品蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，行SDS-PAGE，80 V 約4 h。電泳完后取下凝膠，電轉至PVDF 膜，用50 g/L 的脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h。兔抗人 MMP-2 抗體 MMP-2 一抗\\( 1∶500\\) 37℃孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次。加 HＲP 標記的山羊抗兔二抗 37℃ 孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次，ECL 發光顯色。用 Quantity One 定量分析軟件分析吸光度比值。
1． 2． 6 統計學分析 實驗結果用 x ± s 或 百分比表示，用SPSS18． 0 統計軟件包進行分析，多組定量資料比較用方差分析，組間比較用 t 檢驗。實驗結果以 P ＜0．05 為差異有統計學意義。
2 結果
2． 1 質粒 psiHBV/X 酶切、測序 psiHBV /X 為氨芐抗性質粒，經轉化 DH5α 后，對從陽性菌落中擴增提取的質粒 psiHBV/X 進行酶切，psIHBV/X 表達載體未被酶切和經 SalⅠ酶切后，大小基本相等，經 Hind Ⅲ和EcoＲⅠ雙酶切后重組體質粒產生 2 800 bp、395 bp 左右的2 個條帶，經 Xba Ⅰ酶切成約 3 100 bp 的 DNA 片段，證實重組表達質粒 psIHBV/X 構建正確\\( 圖 1\\) 。將質粒送到生工測序，引物為 U6 啟動子的通用引物，測序結果顯示 shＲNA 的表達模板 5'-TCGAG-GAACCAACAAGAAGATGAG TTCGCTCATCTTCTTGT-TGGTTCTTTTT-3'成功插入了載體中。證實特異表達載體 psiHBV/X 構建正確。psiHBV/X 質粒插入測序結果\\( 下劃線為小干擾 ＲNA 的作用靶點\\) : GCTT-TATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCGA G-GAACCAACAAGAAGATGAGTTCGCTCATCTTCTTGT-TGGTTCTTTTTCTAGAGCGGACTTCGGT。
2． 2 ＲT-PCＲ 檢測 HepG2． 2． 15 細胞 HBx 基因的表達 ＲT-PCＲ 檢測結果顯示 psiHBV/X 組 HBx 表達量低于其它各組，差異有統計學意義\\( P ＜ 0． 01，圖 2、表 1\\) ，抑制率為 53． 60%。而其他各組表達量差異無統計學意義\\( P ＞0． 05\\) 。2． 3 psiHBV /X 轉染抑制細胞的增殖 MTT 法結果顯示: 空白組24、48、72 h A490的吸收值分別為0．44 ±0． 03、0． 73 ± 0． 02、1． 11 ± 0． 05，而 psiHBV / X 組 24、48、72 h A490的吸收值分別為0．39 ±0．09、0．62 ±0．02、0． 99 ± 0． 04。說明 psiHBV / X 組在轉染后 24、48、72 h都對細胞生長具有抑制作用，與對照組相比差異有統計學意義\\( P ＜0．05，圖3\\) 。2． 4 psiHBV /X 轉染抑制細胞 MMP-2 mＲNA 表達標準曲線線性良好，具有可重復性，證明 ＲNA 有較好的擴增能力。由融解曲線圖可知各實驗組曲線峰值單一，主峰位置基本一致，無雜峰，說明產物均一。實驗結果使用2－ △△Ct法進行分析，結果顯示: 空白對照組、脂質體組、質粒對照組表達無顯著差異\\( P ＞0． 05，表 2\\) ，干擾 24 h 實驗組和 48 h 實驗組MMP-2 mＲNA 的表達較其它組明顯下調\\( P ＜ 0． 01\\) 。2． 5 psiHBV /X 轉染抑制 MMP-2 蛋白表達 轉染24、48 h 后收集各組細胞，提取總蛋白，Western blot法檢測轉染后各組細胞 MMP-2 蛋白表達變化。結果所示: 空白對照組、脂質體組、空載體組比較，表達無顯著差異\\( P ＞0． 05\\) ，干擾 24 h 實驗組和 48 h 實驗組 MMP-2 蛋白表達下降，與對照組比較差異具有統計學意義\\( P ＜0． 05，圖 4，表 3\\) 。
3 討論
全球有 3． 5 億人感染 HBV，HBV 是肝細胞癌\\( HCC\\) 的致病因子已得到公認。HBx 基因是 HBV病毒基因組中最小的開放性讀碼框，是 HBV 復制的關鍵基因。HBx 蛋白是一種多功能蛋白，與甲基轉移酶 PＲMT1 結合可調節乙肝病毒的轉錄，并參與細胞周期與凋亡調控、信號轉導通路、DNA 復制、細胞黏附和肝癌發生等病理過程，HBx 蛋白可干擾先天免疫的 ＲIG-I 通路從而影響病毒的復制。HBx蛋白在肝癌的發生發展中起重要作用。HBx 基因轉染可加快肝癌細胞周期的進程，促進肝癌細胞生長，使肝癌細胞惡性程度增高。也有研究顯示 HBx 可通過上調 HIF-1 的表達，從而促進腫瘤血管生成及轉移。因此，HBx 可作為阻斷 HBV 感染相關性肝癌發生發展的靶基因。
MMP 能降解 ECM 中的蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵性作用，從而在腫瘤浸潤轉移中的作用日益受到重視，被認為是該過程中主要的蛋白水解酶。目前 MMP 家族已分離鑒別出26 個成員，其中 MMP-2 基因位于人類染色體 16q21，由 13 個外顯子和 12 個內含子所組成。研究發現，MMP-2 與肝癌、宮頸癌、膠質瘤等多種腫瘤的浸潤侵襲有關。另有研究報道丙型肝炎病毒的感染與 MMP-2 的激活有關。但 HBx在肝癌轉移浸潤中所起的具體作用還需深入研究。
為進一步探索 HBV 感染與肝癌轉移浸潤的關系及其作用機制，本研究用 HBx 干擾載體 psiHBV/X轉染 HepG2． 2． 15 細胞，觀察 HBx 基因沉默后細胞增殖情況及對 MMP-2 表達的影響。實驗結果顯示:
siＲNA 表達載體對 HepG2． 2． 15 細胞增殖有明顯抑制作用，抑制率明顯高于空白對照組、空載體組、脂質體組。同時，空白對照組、空載體組、脂質體組之間的差異無顯著性。結果顯示在轉染后 48 h 抑制效果最佳，72 h 抑制效率下降，其可能原因是 siＲNA 的表達載體隨著細胞的快速分裂而不斷的丟失，從而降低了干擾效率。Ｒeal-time PCＲ 和 Western blot 法檢測結果顯示，轉染 psiHBV/X 后 HepG2． 2． 15 細胞中MMP-2 在基因水平和蛋白水平的表達均下調，且隨著時間的推移這種抑制越來越明顯，提示沉默 HBx基因后 MMP-2 表達受到抑制，因此推測在 HCC 的轉移過程中，HBx 或 HBV 可通過上調 MMP-2 的表達水平而增強肝癌細胞的侵襲能力，也增加了乙肝病毒致癌的可能性。提示 HBx 可作為控制肝癌轉移的一個靶基因。
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