細胞紅蛋白（ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ）是由１９０個氨基酸組成的２１－ｋＤａ蛋白。它的三級結構具有經典的珠蛋白８個螺旋（Ａ至Ｈ），這８個螺旋折疊成三明治結構。與肌紅蛋白、血紅蛋白不同，細胞紅蛋白是一個六配位蛋白。哺乳類動物的細胞紅蛋白廣泛分布于肝臟，心臟，腦，肺，視網膜，食管，腸等各個器官。在大部分器官中，它分布在纖維母細胞及間充質細胞的細胞質，而在腦神經元中，它在細胞質及細胞核中均有分布，提示著它在腦中具有某種特殊的生理功能。自２００１年發現細胞紅蛋白以來，越來越多的研究結果表明它在缺氧應激狀態時時扮演著保護組織、細胞的重要角色。神經細胞是大腦的基本功能單位，承載著大腦的感覺，運動，記憶，思維等各種生理功能。臨床上治療ＨＩＥ時，我們最關心的是神經元的存亡，這和病人的預后有很大的關聯。但迄今為止，關于細胞紅蛋白在體外培養的原代神經元缺氧時表達的研究尚無。本實驗通過Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ監測細胞紅蛋白在原代神經元在缺氧時的表達，為研究細胞紅蛋白在缺氧應激神經細胞中的調節通路提供實驗基礎，從而進一步為缺氧缺血性腦病中的治療奠定基礎。
１材料和方法
１．１實驗動物、主要試劑與儀器孕１８ｄ的ＳＤ大鼠，由汕頭大學醫學院實驗動物中心提供。Ｌ－ＧＬＵ－ＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ），ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基（ＧＩＢＣＯ），Ｂ２７神經營養因子（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ），ＴＲＹＰＳＩＮ＋０．２５％ ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ），ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（ＧＩＢ－ＣＯ），多聚－Ｄ－賴氨酸 （ＳＩＧＭＡ），ＲＥＡＬＴＩＭＥ－ＰＣＲ試劑盒（大連寶生物工程有限公司），即用型免疫組化試劑盒（福州邁新），烯醇化酶一抗（福州邁新）及兔抗鼠二抗（福州邁新），β－ａｃｔｉｎ一抗（武漢博士德），胞紅蛋白一抗（ＳＡＮＴＡ），羊抗兔二抗（博奧森），倒置相差顯微鏡（日本Ｏ－ＬＹＭＰＵＳ公司），ＣＯ２培養箱（蘇州凈化設備），熒光定量ＰＣＲ儀（ＬＩＦＥ），全能顯微鏡（ＬＥＩＣＡ），測氧儀（上海華光），酶標儀（Ｂｉｏ－ｒａｄ）。
１．２方法
１．２．１細胞的培養冰上取孕１８ｄ的胎鼠大腦皮層，用０．０６２５％消化后，加用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基吹打成懸液，用臺盼藍染色進行細胞計數，以２５萬／ｃｍ２種植于預先用多聚賴氨酸包被的六孔板（ＰＣＲ及免疫印跡試驗用）及９６孔板內（ｃｃｋ８用），置于３７℃，５％ＣＯ２的培養箱中進行培養，４ｈ細胞貼壁后換ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ ＋２％Ｂ２７＋Ｌ－ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ繼續培養，每４８ｈ換液１次，培養至第６天用神經元特異性烯醇化酶（ＮＳＥ）免疫組織化學方法神經細胞進行純度鑒定。
１．２．２神經元純度鑒定吸凈培養基，用２％多聚甲醛固定，甲醇雙氧水浸泡，加山羊血清封閉，加一抗（對照組用ｐｂｓ代替），置４°冰箱過夜。第２天ＰＢＳ浸洗后，加二抗３０ｍｉｎ，加辣根過氧化物酶６０ｍｉｎ，ＰＢＳ浸洗后，滴加ＤＡＢ顯色約５ｍｉｎ（顯微鏡下觀察顯色情況），ＰＢＳ沖洗，晾干，樹膠封片。顯微鏡下隨機選?。保皞€視野計數。
１．２．３細胞缺氧。實驗前將培養基５％ＣＯ２和９５％Ｎ２的氣體中過夜。實驗時，將細胞隨機分為４組，其中１組作為正常組（０ｈ），其余３組培養基換為預缺氧的培養基，然后充入５％ＣＯ２和９５％Ｎ２的氣體的真空袋中，分別缺氧８ｈ，１６ｈ，２４ｈ，缺氧后用測氧儀監測氣體的氧濃度，氧氣濃度在０～０．９％之間的進行下一步實驗。
１．２．４熒光定量。ＰＣＲ用Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔａｋａｒａ）、氯仿、異丙醇、７５％乙醇裂解細胞分離沉淀ｍＲＮＡ，適當的ＤＥＰＣ水 溶 解ｍＲＮＡ，紫 外 分 光 光 度 計 測 定ＲＮＡ濃度和ＯＤ值（１．８～２．１），在逆轉錄酶作用下，將ｍＲＮＡ逆轉錄成ｃＤＮＡ。采用熒光染色技術進行實時定量多聚酶鏈反應（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅ－ａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ），獲取各組標本標準曲線，計算機分析Ｃｔ值。７３００系 統 的ＰＣＲ的 反 應 條 件：第 一 階 段９５℃３０ｓ；第二階段９５℃３ｓ，６０℃３１ｓ，４０個循環；第三階段９５℃ １５ｓ，６０℃ １ｍｉｎ９５℃ １５ｓ，ＰＣＲ引物設計如下。ＣＹＧＢ基因，引物為５＇－ＣＣＴＧＧＴＧＡＧ－ＧＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣ－３＇（上游），５＇－ＣＡＧＡＡＴＧＡＣ－ＣＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣ－３＇（下 游）。β－ａｃｔｉｎ（內 參）基因，引物為５＇－ＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧ－３＇（上游），５＇－ＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧ－３＇（下游）。
１．２．５免疫印跡試驗加５０μＬ／孔單去污劑裂解液（含ＰＭＳＦ１００∶１）于六孔板內，超聲波震蕩，置冰上裂解３０ ｍｉｎ后，移至１．５ ｍＬ離心管中，４℃下１２０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ，取上清并分裝于０．５ｍＬ離心管中，保存于－２０℃冰箱中備用?？偟鞍踪|抽提上樣，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離后電轉移至ＰＶＤＦ膜上，用１０％脫脂牛奶封閉液室溫封閉２ｈ后，加入鼠抗人的ＣＹＧＢ多克隆抗體（１∶２００）和β－ａｃｔｉｎ（１∶１０００），４℃孵育過夜，ＴＢＳＴ洗膜１０ｍｉｎ×３次，后加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗（１∶１００００），水平搖床中晃動，室溫孵育２ｈ，ＴＢＳＴ洗膜５ｍｉｎ×４次，暗室曝光。用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ圖像分析系統對分析系統對Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ結果進行分析。
１．２．６細胞活力實驗每個缺氧組設置三個復孔神經元，缺氧前吸靜培養基，ＰＢＳ洗凈后每個孔加ＣＣＫ８試劑１００μＬ，培養２．５ｈ，酶標儀測量ＯＤ１值。
缺氧后再吸靜培養基，ＰＢＳ洗凈后每個孔加ＣＣＫ８試劑１００μＬ，培養２．５ｈ，酶標儀測量ＯＤ２值。算出各組的相對ＯＤ值：ＯＤ＝ＯＤ２／ＯＤ１，分別用８ｈ、１６ｈ、２４ｈ與０ｈ組比較計算出缺氧后各組細胞的生存率。
１．３統計學方法所有數據以ｘ－±ｓ表示，多組計量資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用ＬＳＤ檢驗。Ｐ＜０．０５為差異有統計學意義。
２結果
２．１神經元純度鑒定及細胞缺氧ＳＤ大鼠大腦皮層神經元培養及鑒定 培養６ｄ的海馬神經細胞生長狀態良好，胞體飽滿，多呈梭形、錐形，少數呈多邊形，胞漿豐富，核大，核仁隱約可見，突起聯結成網，神經元特異性烯醇化酶（ＮＳＥ）免疫組織化學方法純度鑒定結果顯示神經元純度大于９９％。見圖１。細胞缺氧后，測氧儀監測的氧濃度波動于０．５％ ～０．９％之間。２．２熒光定量ＰＣＲ 相對于正常組，缺氧組ＣＹＧ－ＢｍＲＮＡ隨著缺氧時間逐漸升高：８ｈ，１６ｈ，２４ｈ分別是０ｈ組的（１．２２±０．２１）倍，（１．４７±０．２８）倍，（１．７４±０．３９）倍，且每組（ｎ＝１２）之間差異有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。見圖２。各組比值見表１。２．３免疫印跡試驗 相對于正常組，缺氧組ＣＹＧＢ隨著缺氧時間逐漸升高：８ｈ，１６ｈ，２４ｈ分別是０ｈ組的（１．５４±０．２１）倍，（２．１８±０．２８）倍，（３．０３±０．４）倍，且每組（ｎ＝４）之間差異有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。見表２、圖３。２．４細胞活力實驗結果 隨著缺氧時間延長，生存率降低：８ｈ，１６ｈ，２４ｈ分別是０ｈ組的（０．９８±０．０１）倍，（０．９６±０．０１）倍，（０．９５±０．０１）倍，且每組（ｎ＝１２）之間差異有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。見圖３，見表３。
３討論
本實驗神經元純度達到９９％以上，氧濃度在０．５％～０．９％，確保了試驗的準確性。細胞活力試驗結果顯示缺氧后神經元并沒有大量死亡（損傷最嚴重２４ｈ組仍有９５％存活率），這或許和老鼠神經元長期處于一種低氧壓的環境有關。眾所周知，活細胞是產生核酸和蛋白的基礎，因此缺氧后神經元的高存活率保證了有足夠的神經細胞產生ＣＹＧ－ＢｍＲＮＡ和蛋白，從而能真實反映ＣＹＧＢ在神經細胞缺氧時如何表達。本實驗熒光定量ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ結果首次證實了低氧使神經細胞在核酸水平和蛋白水平都過表達ＣＹＧＢ。這與前人在其他組織及細胞上做的實驗結果相符，ＥＦｏｒｄｅｌ等證實了在缺氧的心、肝、肌肉、腦中，ＣＹＧＢ含量升高。在體外缺氧實驗中，多種癌細胞包括神經腫瘤細胞株ＨＮ３３、支氣管上皮癌細胞株ＢＥＡＳ－２ｂ、宮頸癌細胞株ＨｅＬａ、多形膠質細胞瘤細胞株中的ＣＹＧＢ含量均增高。增高的程度與缺氧的時間和嚴重程度成正比。有趣的是，在本試驗中，相對于正常組，核酸的升高倍數與蛋白的升高倍數并不平行，蛋白每個時間點的升高倍數都略高于核酸組，這或許與翻譯過程和翻譯后的加工、修飾有關。細胞紅蛋白（ＣＹＧＢ）是在高等脊椎動物上發現的第四種珠蛋白，它廣泛分布于人體各個組織器官。有學者推測它同樣具有儲氧和運輸氧的功能。
ＤＨａｍｄａｎｅ等推測缺氧環境下Ｈ＋、ＮＡＤＨ等還原性物質的存在使ＣＹＧＢ產生變構而易于釋放氧，從而使其可以有效的行使儲氧及運輸氧的功能。有研究證實了ＣＹＧＢ具有過氧化物酶和超氧化物歧化酶的作用，它可以利用亞鐵原卟啉和硫醇殘基清除活性氧 （ＲＯＳ）。人 為 的 使ＣＹＧＢ過表達能在氧化應激是保護細胞，清除活性氧（ＲＯＳ），脂源性活性物質，降低ＤＮＡ的損傷，提高細胞的生存率。敲除ＣＹＧＢ則會使ＲＯＳ清除速度減慢，細胞凋亡率增高。圍生期缺氧缺血性腦?。ǎ龋桑牛┮恢笔切律鷥褐禄椭職埖闹匾?，足月新生兒的發病率約為２～４／１０００，早產兒的發病率更高。腦損傷是不可逆的疾病，有著大腦性麻痹，精神發育遲緩，學習障礙，癲癇等多種嚴重的后遺癥。缺氧使腦細胞線粒體功能失調，能量代謝障礙。隨之而來的是氧自由基、ＲＯＳ、脂質過氧化物的產生從而導致胞內蛋白，ＤＮＡ的損傷，細胞的壞死，凋亡。因此，及時的清除氧自由基，脂質過氧化物酶可以更好的保護腦細胞。近十年來，盡管人們做了大量的研究，但是還沒有一套對ＨＩＥ行之有效的治療方法，開發一些新的治療方法勢在必行。
ＣＹＧＢ的功能和它在腦內的廣泛分布使它成為了治療缺氧缺血性腦?。龋桑诺暮蜻x者之一。在缺氧應激的情況下，人為的增加ＣＹＧＢ表達和敲除ＣＹＧＢ分別能提高細胞的生存率和降低細胞的死亡率以及減少和增加腦組織的死亡面積。但是，之前的試驗之前的實驗雖有證實了ＣＹＧＢ與大腦缺氧之間的關系，但是大腦中細胞種類繁多，并不能直接說明在缺氧情況下ＣＹＧＢ與神經元的直接關系。然而臨床上治療ＨＩＥ時，我們最關心的正是神經元的存亡，這和病人的預后有很大的關聯。本試驗表明神經元在缺氧時確實會上調ＣＹＧＢ，結合證實的ＣＹＧＢ在缺氧時對細胞的保護作用和缺氧后絕大部分神經細胞存活，我們推測ＣＹＧＢ在缺氧應激可以通過清除自由基，脂源性活性物質等作用中保護神經細胞，增強神經元對缺氧的耐受能力，提高神經細胞缺氧時的生存率。因此，ＣＹＧＢ或許可能成為治療ＨＩＥ的新途徑。
然而，ＣＹＧＢ與缺氧應激的關系及它的功能尚存在著一些爭議。ＤＬｉ等將神經母細胞瘤細胞株Ｎ２ａ置于５％（３８．５ｍｍＨｇ）的氧中，并未 發 現ＣＹＧＢ升高。這或許和實驗設計的氧壓過高有關，正常情況下哺乳類動物大腦皮層的平均氧壓（３４．１＋５．６）ｍｍＨｇ，而神經母細胞瘤是神經細胞來源的。因此，５％的氧對于Ｎ２ａ細胞株可能并不算“缺氧”刺激。有學者結扎大腦中動脈后發現梗死區的ＣＹＧＢ并未增高。但是他們在檢測ＣＹＧＢ時，梗死區域細胞已經完全壞死，而且檢測是在２４ｈ之后，并不能排除在細胞未完全壞死時的２４ｈ之 內ＣＹＧＢ已經開始升高。
ＨＩＥ早期細胞未完全壞死，因此ＺｉｎｄｙＲａｉｄａ的結論并不能說明ＣＹＧＢ的表達與ＨＩＥ無關。綜上所述，神經細胞在缺氧時將會上調ＣＹＧＢ，這種ＣＹＧＢ的上調或許是神經細胞的一種自我保護機制，因此，ＣＹＧＢ可能成為改善ＨＩＥ預后的潛在途徑之一。當然，這還有很長的一段路要走。首先，本實驗并未在神經細胞內敲除和過表達ＣＹＧＢ來測試它是否真的具有保護作用。其次，本實驗并未探討它的上下游基因，并不了解它的作用機制。將來的實驗需要進一步驗證這些問題。
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