動脈粥樣硬化（ＡＳ）是一種累及全身血管的慢 性病變。ＡＳ不僅僅是脂質代謝紊亂，同時也是一種慢性炎癥性疾病，多種免疫細胞及細胞因子參與了其發生與進展。單核細胞遷移到內皮下轉化為具有吞噬作用的巨噬細胞，通過清道夫受體（ｓｃａｖ－ｅｎｇｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＳＲ）吞噬脂質形成泡沫細胞，釋放一系列炎性因子及趨化蛋白，啟動炎癥級聯反應，促進ＡＳ進展。此外，泡沫細胞沉積于內皮下，導致內膜進一步改變。白細胞介素（ＩＬ）被認為是調節ＡＳ進展中泡沫細胞形成的關鍵因素。
ＩＬ－３７能夠抑制多種炎性因子的表達，平衡體內促炎因子與抑炎因子，抑制樹突狀細胞的活化，減輕炎癥 反應。有實驗在ＡＳ組織泡沫細胞中檢測到ＩＬ－３７蛋白表達，但其能否影響單核巨噬細胞的泡沫化尚未明確。本研究以人單核細胞系ＴＨＰ－１為對象，體外模擬巨噬細胞泡沫化的過程，觀察ＩＬ－３７的作用，并對可能機制進行探討。
１材料與方法
１．１材料
ＴＨＰ－１細胞系購自美國ＡＴＣＣ公 司，ＲＰＭＩ１６４０及胎牛血清購 自Ｇｉｂｉｃ公 司，ｏｘ－ＬＤＬ購 自ＹｉｙｕａｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司，小鼠抗人ＡＢＣＡ－１單克隆抗體（ｓｃ－５８２１９）購自美國ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ公司，β－Ａｃｔｉｎ（ｓｃ－４７７７８）購自美國ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ公司，兔抗人ＣＤ３６單克隆抗體購自美國ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ公司，小鼠 抗 人ＳＲ－Ａ單克隆抗體購自美國Ｒ＆Ｄ公 司，Ｔｒｉｚｏｌ及ＲＴ－ＰＣＲ試 劑 盒 購 自 日 本Ｔａｋａｒａ公 司，ＣＤ３６引物、ＳＲＡ引物、ＡＢＣＡ－１引物、ＧＡＰＤＨ引物由中國武漢擎科生物公司設計合成。
１．２方法
１．２．１ＴＨＰ－１細胞培養ＴＨＰ－１細胞為懸浮生長細胞，用含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０培養基，培養基加入青霉素（１００Ｕ／ｍｌ）和鏈霉素（１００μｇ／ｍｌ），３７℃、５％ ＣＯ２培養箱中靜置培養，每２～３ｄ傳代１次。
１．２．２巨噬細胞的分化１０００×ｇ、５ｍｉｎ離心上述培養的ＴＨＰ－１細胞，棄上清，按１×１０６／ｍｌ重懸于新的培養基中，接種到６孔板或者細胞培養瓶中，加入ＰＭＡ（終濃度為１６０ｎｍｏｌ／Ｌ），３７℃、５％ＣＯ２培養箱中靜置培養２４ｈ，觀察細胞貼壁和形態改變。
１．２．３分組及建立泡沫細胞模型ＴＨＰ－１細胞（１×１０６／ｍｌ）在１６０ｎｍｏｌ／ＬＰＭＡ刺激２４ｈ分化為巨噬細胞，然后分別給予ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（５ｎｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（２０ｎｇ／ｍｌ）。各組細胞均置５％ ＣＯ２、３７℃孵箱，培養２４ｈ。其中僅給予ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）單獨刺激的對照組再進行進一步分組實驗，一組給予ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ），另一組僅更換新鮮培養基，２４ｈ后收集細胞。
１．２．４油紅Ｏ染色觀察泡沫細胞形態將ＴＨＰ－１培養于放有蓋玻片的６孔培養板內，用ＰＭＡ刺激２４ｈ后，加入ｏｘ－ＬＤＬ和（或）ＩＬ－３７干預２４ｈ。待處理結束后，棄上清，用預冷ＰＢＳ液沖洗３次。４％多聚甲醛固定２～４ｍｉｎ，０．３％油紅Ｏ染色液染色１５～２０ｍｉｎ，蘇木素染色５ｍｉｎ，鹽酸酒精分色，明膠甘油封片，顯微鏡觀察。收集圖像并用圖像分析系統分析。
１．２．５細胞內脂質測定棄干預后的細胞培養液，用預冷ＰＢＳ沖洗３次，冰?。常埃恚椋?，用細胞刮刮下細胞，８００×ｇ離心１０ｍｉｎ，加入０．５ｍｌ的氯仿－甲醇（２∶１）混合液研磨，３０００×ｇ、４℃離心３０ｍｉｎ，取上清液，加兩倍體積的冰生理鹽水，３０００×ｇ離心３０ｍｉｎ，去除上層液體，將下層有機相轉移到干燥的ＥＰ管，用ＴＣ試 劑 盒 測 定ＴＣ，沉 淀 用０．１ｍｍｏｌ／ＬＮａＯＨ０．２ｍｌ溶解，ＢＣＡ法測細胞內蛋白質含量。細胞內膽固醇含量用每克蛋白所含的ＴＣ表示。
１．２．６ＲＴ－ＰＣＲ檢測ＲＮＡ提取上述干預后的細胞，用預冷ＰＢＳ沖洗３次，每孔加入１ｍｌＴｒｉｚｏｌ，靜置１０ ｍｉｎ，用槍吹打 數次，吸入無ＲＮＡ酶 的１．５ｍｌＥＰ管中，每管加入２００μｌ氯仿，震蕩數秒，室溫靜置１０ｍｉｎ，１２０００×ｇ、１５ｍｉｎ，４℃，離心；吸取上層液體層２００～３００μｌ到另一ＥＰ管中，等體積加入預冷的異丙醇，輕輕混勻，－２０℃，放置１０ｍｉｎ，１２０００×ｇ、１５ｍｉｎ，４℃離心；棄上清，加入１ｍｌ預冷無水乙醇，７５００×ｇ、１０ｍｉｎ，４℃，離心；盡最大可能將上清丟棄，加入２０μｌ的ＤＥＰＣＨ２Ｏ。
ＲＮＡ濃度和純度測定?。宝蹋焖崛〉模模危寥芤杭尤耄梗功蹋欤模牛校盟?，充分混勻，然后用核酸分析儀檢測Ａ２６０，Ａ２６０／Ａ２８０比值，ＲＮＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ２６０×１００×稀釋倍數，Ａ２６０／Ａ２８０比值在１．８～２．０純度較高。逆轉錄溫度梯度ＰＣＲ儀按３７℃１５ｍｉｎ、８５℃５ｓ、４℃的程序進行逆轉錄。
ＰＣＲ引物序列 引 物 序 列 如 下：
ＧＡＰＤＨ：５′－ＣＣＡＣＣＣＡＴＧ－ＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡ －３′，５′－ＴＣＴＡＧＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣ－３′；ＣＤ３６：５′－ＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＡＴ－ＧＧＧＧＣＴＡＴ－３′，５′－ＴＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＡＡＧ－Ｇ－３′；ＳＲ－Ａ：５′－ＣＣＡＧＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＡ－３′，５′－ＣＣＡＧＴＧＧＧＡＣＣＴＣＧＡＴＣＴＣＣ－３′；ＡＢＣＡ１：５′－ＴＧＴ－ＣＣＡＧＴＣＣＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧ －Ｔ３′，５′－ＡＡＧＣＧＡ－ＧＡＴＡＴＧＧＴＣＣＧＧＡＴＴ －３′。
ＲＴ－ＰＣＲ按Ｔａｋａｒａ公司ＰＣＲ試劑盒說明，按ＲＯＸ０．２μｌ，ＳＹＢＲ?ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭＩＩ５μｌ，ＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ０．２μｌ，ＰＣＲＲｅ－ｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ０．２μｌ，ＤＮＡ模板１μｌ，ｄＨ２Ｏ３．４μｌ，配制１０μｌ擴增體系；采取兩步法ＰＣＲ擴增標準程序：９５℃、３０ｓ，９５℃、５ｓ，６０℃退火、延伸３０ｓ，共４０個循環。
１．２．７Ｗｅｓｔｅｒｎ印跡檢測蛋白質提取上述干預后的細胞，預冷ＰＢＳ沖洗３次，細胞刮用力將細胞刮落，用１ｍｌＰＢＳ重懸于１．５ｍｌＥＰ管中，３０００×ｇ、１０ｍｉｎ，４℃離心，棄上清，加入現配的與沉淀體積約等的細胞裂解液和蛋白酶抑制劑復合物，將沉淀吹散，冰?。常埃恚椋?，３０ｓ、６次渦旋，間隔５ｍｉｎ進行１次；１２０００×ｇ、１０ｍｉｎ，４℃，離心；吸取上清為細胞蛋白質。蛋白濃度測定和變性按照ＢＣＡ蛋白測定試劑盒的說明，用酶標儀檢測樣本的蛋白濃度。而后按每個樣本上樣６０μｇ分裝樣本到２００μｌ的ＥＰ管中，９５℃、１０ ｍｉｎ，使蛋白變性。
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ電泳按濃縮膠６０～８０Ｖ恒壓，分離膠１００～１５０Ｖ恒壓，到蛋白Ｍａｒｋｅｒ條帶區分明顯或者溴酚藍到達分離膠最低端；轉膜用３００ｍＡ恒流，根據目標蛋白分子量大小決定轉膜時間；５％脫脂奶粉封閉３ｈ，ＴＢＳＴ洗滌５ｍｉｎ、３次，一抗按說明書要求稀釋，搖床冰浴過夜；ＴＢＳＴ洗滌５ｍｉｎ、３次，二抗按１∶３０００稀釋，封閉２ｈ；ＴＢＳＴ洗滌５ｍｉｎ、３次，用ＩｍａｇｅＬａｂ成像系統檢測并收集圖像。
１．３統計學處理
實驗均重復３次，實驗數據以珚ｘ±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ１２．０作統計學處理。組間數據處理根據方差齊性分析的結果，進一步使用ＳＮＫ檢驗，進行組間差異的比較，Ｐ＜０．０５為差異有統計學意義。
２結果
２．１泡沫細胞形態及細胞內脂質測定光固定和油紅Ｏ染色光鏡下顯示，ＩＬ－３７＋ｏｘ－ＬＤＬ組細胞攝?。铮蹋模虦p少，胞內脂質小滴顯著減少，油紅Ｏ染色陽性細胞較ｏｘ－ＬＤＬ組顯著減少，且細胞形態多改變較 少 （圖１）。ＩＬ－３７＋ｏｘ－ＬＤＬ組巨噬細胞內ＴＣ水平較ｏｘ－ＬＤＬ組顯著減少［（１５０．４±７．３６）ｎｇ／ｍｇ∶（３０３．１±８．９）ｎｇ／ｍｇ，Ｐ＜０．０１］。２．２ＴＨＰ－１源巨噬細胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１的表達水平Ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）組和ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）組ＴＨＰ－１源巨噬細胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１蛋白及ｍＲＮＡ表達水平見表１，不同濃度ｏｘ－ＬＤＬ組表達水平見表２。２．３泡沫細胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１的表達水平Ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）組和ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ｏｘ－ＬＤＬ（５０ ｍｇ／ｍｌ）組 泡 沫 細 胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１蛋白及ｍＲＮＡ表達水平見表３。
３討論
ＡＳ是是一種多因素參與的病理過程。脂質代謝紊亂和炎癥反應是致ＡＳ的最主要的兩個原因，彼此相互促進，加速ＡＳ的進展。血液中的單核細胞遷移進入內皮下分化為巨噬細胞，通過ＳＲ吞噬血管內膜下聚集的脂質尤其是ｏｘ－ＬＤＬ形成泡沫膜細胞，啟動ＡＳ的進程。泡沫細胞聚集形成斑塊是ＡＳ的主要病變特征，同時泡沫細胞的形成啟動了動脈內皮下慢性炎癥級聯反應，促進病變的進展。
研究表明，多種細胞因子在ＡＳ泡沫細胞的形成中發揮了重要作用。這些細胞因子可以通過上調或下調巨噬細胞表面ＳＲ，調節巨噬細胞對脂質的攝取，促進或者抑制泡沫細胞的形成；也可以通過上調或下調巨噬細胞逆向脂質運輸相關蛋白的表達，延緩或加速泡沫細胞的形成。巨噬細胞通過細胞表面表達的一系列ＳＲ識別、攝取內皮下脂質；同時也表達逆向膽固醇轉運蛋白，處理胞內聚集的脂質；二者的失衡將影響泡沫細胞的形成。
本實驗表明，ＩＬ－３７能夠抑制ＴＨＰ－１源巨噬細胞攝?。铮蹋模?，促進胞內脂質外流，減少泡沫細胞的形成，具有抗ＡＳ的作用。我們通過油紅Ｏ染色從形態學觀察到ＩＬ－３７能夠減少ＴＨＰ－１源巨噬細胞形成泡沫細胞，降低ＴＨＰ－１源巨噬細胞胞內ＴＣ的聚集。與ＩＬ－１０通過多種機制減少泡沫細胞的形成，其中有些存在爭議。本實驗明確了ＩＬ－３７抑制泡沫細胞的機制，與ＩＬ－３３、ＴＧＦ－β相似，ＩＬ－３７通過抑制ＳＲＡ和ＣＤ３６，同時增強逆向膽固醇運輸蛋白ＡＢＣＡ１的表達，減輕巨噬細胞脂質負荷，減少泡沫細胞的形成，且該作用具有濃度依賴性。此外，用ＩＬ－３７和ＰＭＡ同時刺激ＴＨＰ－１的分化，能夠減少巨噬細胞的形成，并且抑制所活化的巨噬細胞形態的改變，如變形、伸出偽足的細胞明顯減少，與之前的研究一致。
研究表明，ＩＬ－３７具有下調多種炎性因子的作用，減少體內樹突狀細胞的數量，且可以下調樹突狀細胞表面蛋白ＣＤ８６和ＭＨＣⅡ表達量，減輕固有免疫和適應性炎癥反應。與ＩＬ－３３和ＩＬ－１α相似，ＩＬ－３７具有雙重生物學活性，一方面作為可溶性細胞因子，通過與ＩＬ－１８α或者ＩＬ－１８ＢＰ結合，發揮抗炎作用，但是詳細的機制尚未闡明；另一方面成熟的ＩＬ－３７作為核轉錄因子進入細胞核，與Ｓｍａｄ３相互作用，調節多條信號通路的關鍵酶，包括ＦＡＫ、ＰｙＫ２、ＭＡＰＫｐ３８、ＳＴＡＴｓ１－４等。轉染ＩＬ－３７的ＴＨＰ－１細胞，受到ＬＰＳ和ＩＦＮ－γ刺激后，與對 照 組 相 比，ＦＡＫ、Ｐｙｋ２、ＭＡＰｋｉｎａｓｅｐ３８α、ＳＴＡＴｓ、ｐ５３、ＴＯＲ的表達顯著下調［１］；其中ＳＴＡＴ是脂質代謝ＪＡＫ／ＳＴＡＴ信號通路的關鍵轉錄因子，通過調控ＡＢＣＡ１的表達影響吞噬細胞逆向轉運胞內脂質；此外，ｍＴＯＲ信號通路、ＭＡＰＫ信號通路也參與了巨噬細胞的脂質代謝。所以，我們推測成熟的ＩＬ－３７進入細胞核后，與Ｓｍａｄ３結合，通過多條脂質代謝通路調節巨噬細胞ＳＲ和膽固醇逆向轉運受體的表達，調控巨噬細胞泡沫化，從而影響ＡＳ的進程。
ＳＲ和逆向膽固醇轉運蛋白是巨噬細胞泡沫化的關鍵因素，ＳＲＡ和ＣＤ３６是巨噬細胞結合和攝?。铮蹋模痰闹饕荏w，ＡＢＣＡ１是巨噬細胞內膽固醇外流的重要轉運體。敲除ＣＤ３６基因后小鼠以及同時敲除ＣＤ３６，ＳＲＡ基因小鼠ＡＳ進程明顯延緩；而上 調ＡＢＣＡ１則 能 夠 延 緩ＡＳ的 進 展，表 明ＣＤ３６、ＳＲＡ和ＡＢＣＡ１起著重要的作用。本實驗結果表明，ＩＬ－３７可以顯著抑制ＣＤ３６和ＳＲＡ的表達，促進ＡＢＣＡ－１的表達，且有劑量依賴關系。此外，對 已 形 成 的 泡 沫 細 胞，ＩＬ－３７也 能 顯 著 上 調ＡＢＣＡ１，下調ＳＲＡ和ＣＤ３６的表達。
綜上所述，ＩＬ－３７具有抗ＡＳ的作用。結合之前關于ＩＬ－３７具有下調多種炎性因子、抑制炎性細胞活化、減輕炎癥反應的研究，相信ＩＬ－３７有可能會成為ＡＳ預防和治療的新靶點。
參考文獻
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