小腸黏膜下層\\(small intestinal submucosa，SIS\\)作為一種天然的細胞外基質，無抗原性，作為一種細胞支架成功地應用于骨髓基質干細胞、脂肪基質干細胞及肌細胞等多種細胞的實驗研究和臨床實踐，取得了較好的效果，驗證了SIS具有較好的安全性和療效，但小腸黏膜下層能否應用于人牙本質再生與修復的研究，至今國內外罕見報告，我們擬在體外培養人牙髓干細胞\\(hDPSCs\\)，采用四唑鹽比色法（MTS）、茜素紅染色法、堿性磷酸酶\\(ALP\\)和逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）方法觀察牙髓干細胞在豬小腸黏膜下層的生長情況及測定細胞的牙向分化能力，研究SIS對DPSCs的生物相容性及促進牙向分化能力的影響。
材料和方法。
1.主要試劑和儀器。低糖型DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、I型膠原酶（Gibco公司，美國\\)；β-磷酸甘油鈉、維生素C、茜素紅S\\(Sigma公司，美國\\)；二甲基亞砜（DMSO）（Nunc公司，美國）；MTS試劑盒（Promega公司，美國）；堿性磷酸酶\\(ALP\\)試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；TRIzol（Invitrogen，美國）；RNA抽提試劑盒、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（Fer－mentas公司，美國）；牙本質基質蛋白\\(DMP-1\\)、牙本質涎磷蛋白\\(DSPP\\)及內參β-action引物（上海生物工程有限公司）；倒置相差顯微鏡及照相系統（Olympus公司，日本）；平底96孔培養板、24孔培養板、70μm細胞篩網（Falcon公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（BIO-TEK公司，美國\\)；離心機、二氧化碳恒溫孵箱\\(Forma，美國\\)；YJ一875型超凈工作臺\\(鄭州凈化設備廠\\)。
2.DPSCs的培養和鑒定
2.1DPSCs的原代培養收集正畸治療拔除的新鮮年輕恒牙，表面滅菌處理后，無菌條件下取出牙髓，切除根尖約2mm的牙髓，0.01mol／L滅菌PBS沖洗后剪成約lmm×1mm×1mm大小組織塊，0.3％的I型膠原酶37℃消化40min，1000r／min離心5min，棄上清，加入少量培養液，輕輕吹打離散細胞團塊，將形成的單細胞懸液通過孔徑為70μm的細胞篩網，1000r／min離心5min，用含10％胎牛血清的DMEM\\(含有0.292mg／mL谷氨酰胺、100U／mL青霉素／鏈霉素\\)培養液重懸細胞，按1×105個／mL的密度接種于培養瓶。置于37℃、5%CO2培養箱內靜置培養，每3d換液1次，待細胞生長匯合達80％時，0.25％胰酶消化傳代。
2.2DPSCs的克隆化培養和鑒定將對數生長期的第三代DPSCs以胰酶消化，反復吹打細胞制成細胞懸液。將細胞懸液調整密度為1×105個/mL，乙醇固定30min,PBS洗滌后，加入FITC標記的鼠抗人STRO-1單克隆一抗，于室溫孵育1h；PBS再次洗滌后加入羊抗鼠Ig-FITC；流式細胞儀檢測細胞表面STRO-1的表達水平。
3.SIS制備取健康成年豬近端空腸約15cm，清水沖洗干凈后浸于無菌生理鹽水中,刮除漿膜層和肌層,獲得SIS。生理鹽水反復沖洗后，按文獻Abraham方法脫細胞處理,凍干，剪成與96孔板和12孔板的孔大小的材料。環氧乙烷消毒24h備用。
4.SIS對DPSCs增殖的影響將SIS置于96孔板中并加入含10％胎牛血清的DMEM150μL，培養24h，棄去原培養液，將DPSCs的單細胞懸液以2×104個/孔接種于96孔板材料上，加入DMEM培養，每隔3d換液1次。另設無材料的空白對照組,相同條件培養。
分別于培養后1d，3d，5d和7d，取實驗組與空白對照組各5個復孔，棄去原培養液，每孔中加入100μL無血清培養液和20μLMTS，繼續在37℃的孵箱中培養4h，將上清移入另外一個96孔板，空白管調零，在酶聯免疫檢測儀上以490nm波長測定各孔OD值，求均值，繪制細胞生長曲線。
5.SIS對DPSCs礦化功能的影響取體積約2cm3的SIS置于無菌培養瓶內，加入DMEM培養基10mL，于37℃、5%CO2培養箱內浸泡24h，提取上清液，制備成材料浸出液。加入10%胎牛血清，4℃保存備用。將DPSCs的單細胞懸液以2×104個/孔接種于12孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液培養，待細胞匯合后，隨機分為實驗組和對照組，每組5復孔，實驗組加入SIS浸提液，對照組用含有10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養。每3d換液1次，連續培養3周。進行茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察鈣化結節形成情況。
6．SIS對DPSCsALP的影響將DPSCs的單細胞懸液以2×104個/孔接種于96孔板材料上和無材料的空白孔，加入DMEM培養，每隔3d換液1次。
分別于培養后1d，3d，5d和7d，取實驗組與空白對照組各5個復孔，棄去原培養液，PBS洗滌細胞3次，吸干，每孔加入50μL的0.2%的TritonX-100，37℃孵育40min后，按ALP試劑盒操作加入ALP底物，將上清移入另外一個96孔板，空白管調零，在酶聯免疫檢測儀上以520nm波長測定各孔OD值，求均值，繪制細胞生長曲線。
7．RT-PCR檢測基因表達將DPSCs的單細胞懸液以2×104個/孔接種于12孔板材料上和無材料的空白孔，加入DMEM培養，每隔3d換液1次。在培養7d時，棄去原培養液，PBS洗3遍，胰酶消化細胞，實驗組過篩70μm,收集細胞，參照RT-PCR試劑盒說明書，進行RT-PCR。
具體步驟：提取細胞總RNA，將5μg總RNA逆轉錄為cD－NA后行PCR。引物序列:DSPP-正義：5′-TAAGGACAAGGACGAATC-3′；DSPP-反義：5′-ACTGCTGTCACTGCTTTC-3′；DMP-1-正義：5′-CGGCTGGTGGTCTCTCTAAG-3′；DMP-1-反義：5′-GTCCCTCTGGGCTATCTTCC-3′。β-actin-正義：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′；β-actin-反義：5′-CATAGCACAGCTTCTCTT；TAA-3′作為內參。預期產物分別為：472bp（DSPP）、705bp（DMP-1）、283bp（β-actin）。反應條件為：94℃5min，（94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s）30個循環，72℃延長1min。取10μLPCR擴增產物點樣于1%瓊脂糖凝膠，80V恒壓1h，凝膠成像系統分析產物。
8．統計學處理實驗結果用SPSS12.0統計軟件處理，各組之間采用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，P<0.05為有統計學差異。
結果
1．體外原代培養的DPSCs接種12h后開始貼壁伸展，到7d左右達80％匯合。96孔板有限稀釋法克隆化培養14d，細胞克隆形成。純化的DPSCs，細胞繁殖能力強，3～4d可再次傳代。倒置顯微鏡下觀察，多數為長梭形的成纖維細胞樣細胞，少數為多角形及不規則形\\(圖1A\\)。流式細胞檢測的結果表明，克隆培養的DPSCsSTRO-1（40.6%）表達陽性\\(圖1B\\)。陽性STRO-1為早期間充質干細胞的標記物。
2．SIS對DPSCs增殖活性的影響連續培養7d，兩組細胞均保持持續增殖，對比實驗組和對照組細胞生長曲線，培養3d,5d和7d，SIS組的細胞增殖能力比對照組明顯增強\\(P<0.05\\)，SIS對DPSCs的增殖有著顯著的促進作用\\(圖3\\)。
3．SIS對DPSCs礦化功能的影響SIS浸提液誘導DPSCs3周后的茜素紅染色，光學顯微鏡下可見有紅色礦化結節形成。對照組未見礦化結節形成\\(圖2\\)。
4．SIS對DPSCsALP活性的影響接種在SIS材料上的DPSCs連續培養過程中，發現隨培養時間的延長，兩組細胞ALP活性均保持持續增高，對比實驗組和對照組細胞生長曲線，培養3d,5d和7d，SIS組細胞的ALP活性比對照組明顯增高\\(P<0.05\\)，SIS對DPSCs的ALP活性具有顯著促進作用\\(圖4\\)。
5．SIS誘導DPSCs中DSPP和DMP-1基因表達接種在SIS材料上的DPSCs培養1周后，RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析后，實驗組可見472bp\\(DSPP\\)和705bp（DMP-1）大小的特異性擴增產物條帶，對照組未出現特異性擴增條帶（圖5）。表明SIS誘導了DPSCs表達成牙本質細胞的特異性標志DSPP和DMP-1。
討論
組織工程牙齒研究中，種子細胞和支架材料直接關系到組織再生成功與失敗。2000年，Gronthos等從牙髓組織中分離出具有干細胞特性的細胞，并進一步研究表明該細胞不僅在體外經誘導后可分化為成牙本質樣細胞，而且在體內能形成牙本質-牙髓復合體樣結構，從而首次提出了牙髓干細胞的概念，為實現天然牙齒的構建提供了可喜的前景。牙本質-牙髓復合體的形成是牙本質再生的必要條件。因此，DPSCs已被認為是牙齒組織再生與修復的首選種子細胞。
本實驗通過研究SIS對DPSCs的體外增殖及分化的影響實驗，探索SIS能否成為牙齒組織工程的優良支架材料。
牙齒組織工程中，良好支架除了能夠為種子細胞提供載體，更重要的是具有與周圍組織相一致的化學穩定性和物理特性，提供良好的生物相容性，利于細胞的貼附、增殖和牙向分化，SIS是從豬空腸黏膜下層分離出的無細胞膠原層，無免疫特性，內部含有豐富的有助于細胞生長的蛋白和細胞因子，包括膠原，糖蛋白，蛋白聚糖，血管內皮生長因子，成纖維細胞生長因子和轉化生長因子,能夠為細胞生長提供良好的生理微環境。本實驗發現DPSCs在SIS材料上及其浸提液中能夠正常貼附、生長、繁殖，證明了該生物材料有良好的細胞相容性。MTS檢測結果顯示經SIS誘導后的DPSCs增殖的OD值明顯大于對照組，進一步證明該生物材料對DPSCs有著良好的生物相容性，能促進細胞增殖。
本實驗中，我們通過檢測ALP活性，茜素紅染色及RT-PCR分析了SIS對DPSCs的牙向分化能力的影響。發現經SIS誘導后DPSCs的ALP活性較對照組明顯增強，其浸提液誘導后的DPSCs形成大量礦化結節。
此外，我們還發現經SIS浸提液誘導后的DPSCs可以形成礦化結節，證明SIS促進了DPSCs分化。此外，RT-PCR研究進一步發現，經SIS誘導后DPSCs在mRNA水平表達DSPP和DMP-1。ALP的活性和礦化結節的形成是牙源性細胞向礦化表型分化的早期標志，是成牙本質的基礎，其形成能力是評價DPSCs功能的重要指標。DSPP和DMP一1基因是成牙本質過程中，牙本質細胞分化和基質礦化的相關基因，調控著牙本質的礦化。SIS包含有超過90％的I型和Ⅲ型膠原，以及纖維粘連蛋白\\(FN\\)。I型膠原是骨有機質組成的主要成分，在體內為鈣鹽的沉積提供支架，體外實驗研究中，I型膠原促進DPSCs向成牙本質細胞誘導分化。
因此，以上特異性的牙本質礦化標志物在誘導后DPSCs中的陽性表達可充分說明SIS中生物活性因子促進了DPSCs的牙向分化，形成大量細胞外基質。
本實驗結果顯示，體外細胞培養中，SIS促進了DPSCs的增殖、誘導了DPSCs向牙本質樣細胞分化，有良好的生物相容性，為DPSCs提供一個良好的牙向分化的微環境，是一種良好的牙本質組織工程生物材料;但是，脫礦牙本質基質誘導干細胞牙向分化過程中的分子調控機制尚不清楚，仍需進一步的研究。
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